为了研究微生物的发育和功能多样性，并评估它们对环境变化的反应，独立于培养的分子技术已被广泛采用。常用的两种方法包括高密度16S基因寡核苷酸微阵列PhyloChip和16S rRNA基因片段的高通量测序，用于确定微生物群落组成结构［6］。此外，元测序技术（如鸟枪式元基因组学、元转录组学或它们的组合）可以用来确定新基因、系统类型、调节因子和代谢途径的功能特征。基于测序的元基因组学和基于杂交的微阵列技术已经在微生物生态学研究中成功应用。它们具有高基因覆盖率和分辨率，通常可以确定微生物群落中微生物类群和功能基因的相对丰度，使得可以进行环境样本之间的比较。相对丰度是微生物群落中特定分类群或基因的比例，能够检测到它们的增加或减少［7-8］。然而，相对丰度不能很好地评估微生物群落规模对分类群和基因丰度的影响。绝对丰度的量化，即功能基因或其转录本的拷贝数，对于评估微生物群落的功能能力和潜力至关重要。使用功能基因丰度信息而不是微生物多样性可以更好地预测氮循环过程。随着高通量微生物元素循环（quantitative microbial element cycling，QMEC）芯片的开发，探究微生物元素化学循环得到快速发展，使得对生态系统中元素循环的认知得到不断加强［9］。因此，本试验基于高通量定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）探究不同温度下的土壤微生物碳氮磷硫元素循环关键过程功能基因的变化趋势，为深入理解土壤关键微生物元素化学循环的温度响应特征提供科学依据。

1 实验部分

1.1 样品采集

土壤样品采集于2018年11月，采样点为广东省茂名市茂南区（21°42′31″N，110°49′31″E），采样现场如图1所示。该地区属于亚热带季风气候区，常年平均气温在22.8~23.4 ℃之间，最冷月份的平均气温为15.1~16.3 ℃，极端低温为0.5 ℃，最热月份的平均气温为28.3~28.7 ℃，极端高温为38.9 ℃。土壤样品随机选取3个间隔不少于10 m的区域，采集0~20 cm的表层土壤，将3个区域的土壤样品混合均匀后低温运至实验室。通过孔径2 mm筛网去除土壤中的碎石、动植物残体等异物后，将大部分样品4 ℃保存，用于后续培养试验。

<G:\武汉工程大学\2023\第4期\曹冬冬-1.tif>[b][a]

图1 采样现场图：（a）现场环境，（b）采样点

Fig. 1 Schematic diagrams of sampling site：

（a） site environment，（b） sampling point

1.2 土壤基础理化性质测定

土壤pH值由玻璃复合电极（LE438， Mettler Toledo， 中国）在土壤和水的质量体积比为1∶2.5的混合液中测定。土壤总碳（total carbon， TC）和总氮（total nitrogen， TN）通过元素分析仪（Vario MACRO cube， Elementar， 德国）测定。土壤有机质（organic matter， OM）采用重铬酸钾比色法测定。土壤铵态氮（ammonium， NH4+）和硝态氮（nitrate， NO3-）使用2 mol/L KCl 溶液提取后，通过连续流动分析仪（SAN++System，Skalar Analytical B.V.， 荷兰）测定。

1.3 试验设计

取15 g（基于土壤干重）的新鲜土壤于120 mL棕色血清瓶中，通过添加离子水使土壤含水量维持在最大田间持水量（water holding capacity，WHC）的60%，在25 ℃预培养1周后，分别在15、25、35 ℃的恒温培养箱中连续培养28 d。每个温度处理设置6个平行，分别于实验开始后的第7 d和28 d进行破坏性取样。测定不同培养温度下的土壤元素循环功能基因的相对丰度。

1.4 高通量qPCR检测方法

1.4.1 土壤DNA提取 采用Fast DNATM Spin Kit for Soil（MP Biomedicals， 美国）从0.5 g土壤样品中提取DNA，使用超微量分光光度计（NanoDrop 2000， Thermo Fisher， 美国）检测DNA浓度和纯度，将纯度合格的DNA样品-20 ℃保存［10］。

1.4.2 分子标记物 QMEC是一种基于qPCR的芯片，包含71个微生物CNPS引物和1个细菌分类群引物，一次可对72个DNA样本或24个样本进行3个重复的并行定量［11］。QMEC共包含72对引物，这些引物分别为：1）编码碳降解过程的apu、amyA、amyX、sga、iso-plu、abfA、manB、xylA、cdh、cex、naglu、chiA、exo-chi、pgu、glx、lig、mnp、pox；2）编码碳固定过程的accA、aclB、acsA、acsB、acsE、frdA、cdaR、korA、mcrA、mct、pccA、rbcL、smtA；3）编码甲烷代谢过程的mxaF、pqq-mdh、mmoX、pmoA；4）编码氮循环过程的nifH、amoA1、amoA2、amoB、hao、nxrA、narG、nirK1、nirK2、nirK3、nirS1、nirS2、nirS3、nosZ1、nosZ2、ureC、hzo、hzsA、hzsB、nasA、napA、gdhA；5）编码磷循环过程的bpp、cphy、phnK、phoD、phoX、gcd、pqqC、ppk、ppx；6）编码硫循环过程的apsA、dsrA、dsrB、soxY、yedZ以及细菌的16S rRNA（515F和907R）基因。

1.4.3 高通量qPCR 使用16S rRNA基因（F525/R907）作为内参基因，通过HT-qPCR（SmartChip Real-time PCR system， WaferGen Biosystems， 美国）定量检测QMEC。芯片反应系统按照仪器手册说明制备。高通量qPCR反应体系为50 μL，包含1 μL的Premix Taq（Takara， 日本）、正向和反向引物各0.2 μmol·L-1、DNA模板1 ng·μL-1、1 mg·mL-1牛血清白蛋白溶液和无核酸水。扩增程序为初始变性10 min（95 ℃），然后40个循环30 s（95 ℃），退火30 s（58 ℃），延伸30 s（72 ℃）。每个引物组进行3次重复反应，溶解曲线通过WaferGen软件自动生成。

1.5 数据统计与分析

测定结果应考虑两项标准：1）多个溶解峰或扩增效率必须在80%~120%的范围内，2）阈值循环数（threshold cycle， Ct）应不高于31。筛选后的数据根据式（1）计算功能基因相对丰度（Rgene），再根据式（2）对相对功能基因丰度（Ngene）进行标准化处理。最后使用实时荧光定量 PCR（LightCycler?480II，Roche，瑞士）测定16S rRNA基因的绝对丰度（A16S rRNA），利用式（3）计算功能基因的绝对丰度（Agene）［9］：

[Rgene=1031-Ct103] （1）

[Ngene=Rfunctional geneR16S rRNA] （2）

[Agene=NgeneA16S rRNA] （3）

所有的数据分析和数据可视化均使用R-4.2.1和相应的程序包完成，单因素方差分析用于比较组间差异显著性。

2 结果与讨论

2.1 土壤基础理化性质

茂名土壤基础理化性质见表1，土壤基础理化性质均以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2.2 不同温度下土壤元素循环功能基因的相关性分析

在所有处理组的土壤样品中共检出52对分子标记物，其中编码碳降解过程的amyX、cdh、exo-chi、ipu、naglu、pgu、pox；编码碳固定过程的accA、acsB、frdA、pccA、rbcL；编码氮循环过程的hao、hzo、hzsA、nas；编码磷循环过程的ppx；编码硫循环过程的dsrB均未被检测出。不同温度下土壤微生物元素循环的功能基因的情况如图2所示。

整体而言，温度为35 ℃时，编码碳降解、碳固定、甲烷代谢和硫循环的功能基因的相对丰度都要显著高于15和25 ℃（p<0.05）。而氮循环中不同的功能基因对温度响应的表现则比较复杂。 例如，培养28 d后，培养温度为15 ℃的处理组中，编码氮循环基因中的amoA2、hzsB、nirK的相对丰度要显著高于25和35 ℃的处理组（p<0.01），而nxrA基因在的相对丰度随温度的变化并不显著，其他氮循环基因相对丰度则是温度为35 ℃时显著高于15和25 ℃（p<0.01）。磷循环中，phoX和gcd基因的相对丰度在15和25 ℃的处理组中显著高于35 ℃处理组（p < 0.01），cphy基因相对丰度在所有处理组中无显著差异，其余编码磷循环的功能基因则是温度为35 ℃时显著高于15和25 ℃（p < 0.01）。

综上所述，温度在35 ℃时，编码碳氮磷硫循环的元素循环的绝大多数功能基因的相对丰度都显著高于其它两个温度，随着培养时间的增加这种显著相关性得到进一步增强，表明介导相关的碳氮磷硫过程的大多数微生物对温度存在着正的反馈响应，这种反馈有可能进一步加强碳氮磷硫元素循环，从而增加土壤活性。另一方面，发现碳循环过程的功能基因和氮循环、磷循环过程的有些功能基因的变化方向并不一致。在氮、磷循环中存在少量随培养温度增加而降低相对丰度的功能基因。这些基因尤其集中于氮素循环中的硝化过程和反硝化过程，这些发现和以往的研究结果相符［12］。这些结果表明，不同的元素循环过程的功能基因的丰度对温度的敏感性和响应规律存在差异，因此温度的改变可能会引起碳、氮、磷循环过程的解耦联。

2.3 不同温度下土壤微生物功能基因特征

不同培养时间下（28、7 d）碳循环相关微生物功能基因丰度比值如图3（a，b）所示，除pmoA基因外，其它碳循环功能基因比值在35 ℃时都要高于15和25 ℃。具体而言，碳降解中的amyA、chiA、manB、sga和xylA，碳固定中的aclB、acsA、acsE、mct和smtA，甲烷代谢中的pqq-mdh都在35 ℃时功能基因丰度比值显著高于15和25 ℃（p < 0.05）。其它的功能基因在不同的培养温度之间无显著差异。

如图3（c）所示， 氮循环相关的功能基因在35 ℃ 处理组中amoA1、amoB、gdh、nirS3、nosZ2基因丰度比值显著高于15和25 ℃处理组（p < 0.05）。其余氮循环相关基因在不同的培养温度之间无显著差异。另外，amoA2（细菌 amoA）基因随温度的增加相对丰度比值逐渐降低。

不同温度下磷循环和硫循环微生物功能基因丰度比较如图3（d）所示，磷循环中的phnK和phoD以及硫循环中的soxY都在35 ℃时功能基因丰度比值显著高于15和25 ℃（p<0.05）。其它功能基因在不同的培养温度之间无显著差异。

综上所述，50%的碳循环基因丰度随培养时间的增加在35 ℃显著增加，表明温度升高能促进部分碳循环途径，而另一部分碳循环功能基因丰度则未呈现显著温度相关性。传统“碳质量-温度”假说，不同质量底物的分解需要不同的活化能，其对于温度提升敏感性表现出差异。因此，可以用来解释微生物碳代谢过程中的不同功能基因温度适应性差异。对于氮循环而言，氨氧化作用是影响整个氮循环的重要过程，其伴随培养时间和温度的变化趋势与其它氮循环功能基因变化趋势之间存在显著差异，并且amoA1（氨氧化古菌amoA 基因）和amoA2（氨氧化细菌amoA 基因）基因的变化趋势相反，这可能与氨氧化细菌与菌氨氧化古菌在环境中的生态位差异有关，其中氨氧化古菌可以适应更广泛的温度范围，在高温环境中有较好的适应性。微生物介导磷循环和硫循环在35 ℃相对比值较高，也是因为驱动的微生物的能适应较高的温度导致的反映［13］。

2.4 土壤微生物非度量多维尺度分析

非度量多维尺度分析（non-metric multidimen-sional scaling，NMDS）的土壤微生物功能的β 多样性表明，不同培养时间及处理温度下土壤微生物关键元素功能基因的多样性存在显著差异（图4）。不同处理组的平行之间存着较好的聚类，沿着NMDS 1坐标轴温度为35 ℃的处理组与15和25 ℃存着明显的分离趋势，沿着NMDS 2坐标轴不同的培养时间也存在一定的分离趋势。结果表明，温度和培养时间是影响土壤微生物的功能多样性的直接因素，其中供试土壤中微生物在35 ℃存在较高的生物活性。结合上述结果较高的培养温度可能通过促进大部分参与土壤碳氮磷硫相关过程酶的酶活性从而加速土壤微生物化学循环过程［14-15］。

<G:\武汉工程大学\2023\第4期\曹冬冬-4.tif>[0.1

0

-0.1][NMDS 2][-0.5 0 0.5

NMDS 1][培养时间 / d][7

28

][温度 / ℃][15

25

35

]

图4 非度量多维尺度分析（NMDS）土壤微生物功能多样性

Fig. 4 Non-metric multidimensional scaling （ NMDS ） plot illustrating diversity of soil microbial functional genes

2.5 温度变化对功能基因响应比的影响

培养28 d后，不同温度下土壤微生物功能基因丰度比较结果如图5所示。在25 ℃/15 ℃条件下，不同功能基因之间无显著差异。在35 ℃/15 ℃和35 ℃/25 ℃条件下，仅氮固定相关 nifH基因的响应比小于1，而其他元素循环相关基因的丰度都大于1，表明35 ℃温度条件有利于促进大多数功能基因丰度的增加。此外，在35 ℃/15 ℃和35 ℃/25 ℃条件下，不同功能基因间的响应比也存在一定的显著性差异，其中硝化作用相关功能基因的丰度受到温度变化的显著影响。其在35 ℃/15 ℃的响应比最大为（12.79 ±1.82），在35 ℃/25 ℃的响应比最大为（8.44±1.79），与上述结果中的基因丰度比结果相互印证。

<G:\武汉工程大学\2023\第4期\曹冬冬-5.tif>[5 10

响应比][碳降解

碳固定

烷代谢

氮固定

硝化作用

反硝化作用

氮固定

其他氮循环

磷循环

硫循环][5 10][5 10][b][a][c][A][A][A][A][A][A][A][A][A][A][BC][B][C][C][C][A][D][BC][B][B][B][BC][BC][E][A][CD][D][BC][BC][B]

注：不同大写字母表示不同温度处理组的差异显著性（p < 0.05）

图5 不同温度之间的功能基因响应比：（a）25 ℃/15 ℃，

（b）35 ℃/15 ℃，（c）35 ℃/25 ℃

Fig. 5 Response ratios of functional genes at different

temperatures （a）25 ℃/15 ℃，（b）35 ℃/15 ℃，（c）35 ℃/25 ℃

3 结 论

土壤微生物碳磷硫关键过程中功能基因整体受到温度变化的影响显著。 其中，63%的功能基因的丰度在35 ℃的培养温度中显著升高，并且这种趋势随培养时间的增加而显著增加。氮循环中的氨氧化过程中的amoA基因的对温度的响应与其他基因相比最为明显，响应比分别为35 ℃/15 ℃的（12.79±1.82）和35 ℃/25 ℃的（8.44±1.79）。而氮循环过程中的氮固定过程功能基因nifH 是唯一随温度增加而丰度下降的基因。因此，土壤微生物碳磷硫关键过程对温度的响应存在一定的趋异性，可能引起土壤元素循环过程的解偶联，从而影响土壤元素循环的平衡。