《武汉工程大学学报》 2021年05期
500-507
出版日期：2021-10-31
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
车前草治疗隐匿性肾炎的网络药理学机制
隐匿性肾炎（latent nephritis）仅表现为轻度蛋白尿和肾小球源性血尿，无水肿、高血压及肾功能损害，故又被称为无症状性蛋白尿和血尿［1］。其以隐匿性强、病情轻微、病程绵长、易复发为特点［2］。据报道，隐匿性肾炎是由于肾血管出现持续痉挛和充血，肾小球滤过膜的通透性出现损害而导致的［3］。此外，有研究表明如果不能及时对隐匿性肾炎进行治疗，有出现肾功能衰竭的可能性，从而严重影响患者的生命健康［4］。目前针对隐匿性肾炎，西医尚无特异性的治疗方案，而中医治疗秉承辨证论治的原则，结合辨病施治，相对西医来讲目前有较高的可行性［5］。临床在治疗隐匿性肾炎方面常以车前草作为重要中药进行治疗。车前草又名车前，为车前科植物车前的干燥全草［6］。其含有桃叶珊瑚苷、车前苷等成分，有利尿、抗菌、消炎、降血压等作用［7］。金顺英等［8］将30例单纯血尿患者随机分组，治疗组每日服鲜车前草汁，对照组注意休息，预防感染。8周后治疗组总有效率达85%以上，而对照组尿常规改变不明显，仅38.7%有效，两者有显著性差异。此外，徐明等［9］拟益气滋肾清利活血法对比肾炎康复片，各治疗30例隐匿性肾炎，结果表明益气滋肾清利活血法疗效明显优于肾炎康复片。由此可见，车前草对治疗隐匿性肾炎具有十分重要的作用。然而，目前尚未有以网络药理学的角度阐明车前草治疗隐匿性肾炎作用机制的研究。网络药理学是一种建立在计算机基础上的研究中药药理的新模式，其可阐明中药活性成分及作用机制，预测中药作用靶点，发现新的适应症，从而增加中药及其制剂的认可度和接受度［10］。本研究拟采用网络药理学与生物信息学结合的方法，通过对车前草活性成分，作用靶点及对应的生物信号通路进行分析，探讨车前草治疗隐匿性肾炎的作用机制与物质基础，为进一步研究车前草治疗隐匿性肾炎的分子机制提供参考依据。1 实验部分1.1 车前草活性成分的筛选与收集以车前草为主题在中药系统药理学数据库TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中收集相关活性成分，设置筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30％，药物类药性（durg-like properties，DL）≥0.18［11］，Caco-2≥-0.4［12］。1.2 车前草活性成分靶点蛋白的筛选 利用TCMSP和Swiss Target Prediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch/），筛选出活性成分对应的靶点蛋白，将靶点蛋白输入Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）和Drugbank数据库（https：//www.drugbank.com/）规范对应基因名。1.3 获取隐匿性肾炎疾病靶点数据本研究以latent nephritis为关键词在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）和Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）中检索并获取与隐匿性肾炎相关的靶点数据，将在两个数据库中获得的靶点基因进行合并，删去重复值，得到隐匿性肾炎对应的靶点基因。1.4 车前草成分-靶点网络的构建将在TCMSP数据库中获得的车前草相关靶点基因信息进行整理，将整理的Network和Type文件导入Cytoscape中以Degree值为指标进行分析，Degree值越高，节点在网络中的作用就越大［13］。因此本研究选择Degree值较高的前15位靶点基因作为治疗隐匿性肾炎的主要靶点基因。并利用Cytoscape软件得到车前草成分-靶点网络图。1.5 获取车前草与隐匿性肾炎的共同基因利用Venny2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对车前草活性成分靶点蛋白和隐匿性肾炎疾病靶点蛋白的结果进行取交集操作，获取车前草治疗隐匿性肾炎的关键基因。1.6 车前草-隐匿性肾炎蛋白互作网络的构建通过构建蛋白质相互作用网络可从生物化学和信号转导角度出发研究化合物和疾病相关蛋白间的相互作用关系［14］。本研究将车前草与隐匿性肾炎的交集基因导入String数据库（https：//string-db.org/）定义来源为Homo sapiens进行分析，设置最低相互作用阈值为medium confidence=0.4［15］，获取蛋白质相互作用信息，将获得的数据导入 Cytoscape软件中分析得到PPI网络图。1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析R语言可以对基因集合进行功能聚类的统计分析和可视化［16］，本研究利用R语言中的Cluster Profiler、Path View等数据包对关键基因进行GO和KEGG富集分析，以P＜0.05为标准，绘制得到GO-BP、GO-CC、GO-MF和KEGG通路柱形图与气泡图。1.8 分子对接在蛋白质结构数据库（protein data bank， PDB， https：//www.rcsb.org/）中下载AKT1、VEGFA、TP53的3D结构，利用Pymol软件去掉水和其余化合物，再通过AutoDockTools软件加氢。在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载活性成分的2D结构，借助Chem3D将2D结构转化为最小自由能的3D结构，最后通过Pymol画出最小结合能的构象。2 结果与讨论2.1 车前草有效活性成分信息收集通过TCMSP数据库，以车前草为关键词进行搜索，并以OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥-0.4为筛选条件，共筛选得到8种有效活性成分，对应的信息如表1所示。表1 车前草活性成分信息表Tab.1 Active ingredients of plantain[活性成分中文名称 OB / % DL Caco-2 丁那丁 30.97 0.27 0.48 黄芩素 33.52 0.21 0.63 谷甾醇 36.91 20.75 1.32 6-羟基木犀草素 46.93 0.28 0.14 豆甾醇 43.83 0.76 1.44 木犀草素 36.16 0.25 0.19 棕榈酸豆甾醇醋 38.09 0.40 1.42 β-谷甾醇棕榈酸酯 30.91 0.40 1.46 ]2.2 车前草成分-靶点网络图的构建以1.4的步骤进行操作，得到车前草成分-靶点网络图如图1所示。图1中CQC1为丁那丁、CQC2为黄芩素、CQC3为谷甾醇、CQC4为6-羟基木犀草素、CQC5为豆甾醇、CQC6为木犀草素、CQC7为棕榈酸豆甾醇醋、CQC8为β-谷甾醇棕榈酸酯。根据Cytoscape分析结果显示，图1共有266个节点，358条边。以Degree值为分析指标结果显示，β-谷甾醇棕榈酸酯、棕榈酸豆甾醇醋的度值为101，木犀草素的度值为58，黄芩素的度值为38。度值越高，节点在网络中的作用就越大［13］。而上述4种活性成分的度值远大于其他活性成分。因此，本研究选取度值排名前四的活性成分作为治疗隐匿性肾炎的主要活性成分。2.3 车前草-隐匿性肾炎共同靶点的筛选将通过数据库获取得到的车前草对应基因256个与隐匿性肾炎对应基因832个利用Venny2.1.0平台取交集处理后共获得85个交集基因。结果如图2所示。2.4 车前草-隐匿性肾炎蛋白互作网络的构建将85个交集基因导入String数据库和Cytoscape软件中，得到交集基因的蛋白互作网络图，结果如图3所示。将85个交集基因导入String数据库中，分析得到蛋白互作网络共有105个节点，1 536条边，平均节点度值为29.3。再将String数据结果导入Cytoscape中得到如图3所示的蛋白互作网络图。以Network Analyzer等插件对基因靶点进行分析。度值（Degree）、最短路径（Closeness）是判断一个网络节点重要性的主要拓扑参数，度值和最短路径越大，节点在网络中发挥的作用就越大［17］。因此，本研究筛选度值和最短路径排名前15位的基因为核心基因，如图3绿色圆圈所示。核心基因的具体度值和最短路径指数如表2所示。根据图3和表2分析结果可知，TP53、VEGFA、AKT1等核心基因最有可能是治疗隐匿性肾炎的核心基因。研究表明，IL6在炎症调控中作为重要物质参与抗肿瘤过程［18］。VEGFA异常表达会导致肾脏的高滤过、基底膜增厚、肾小球肥大，从而加剧了肾功能恶化［19］。AKT1是一种蛋白激酶，该蛋白参与多种生物学过程，包括细胞代谢、增殖，结合多条信号通路，达到治疗隐匿性肾炎的目的［20］。TP53是重要的凋亡基因，通过调控BCL2线粒体凋亡机制可促进肿瘤细胞凋亡［21］。这些核心基因可能是车前草治疗隐匿性肾炎的重要靶点。2.5 GO和KEGG通路富集分析利用R语言对交集基因进行GO富集分析，得到GO富集分析柱形图如图4所示。图4是以P＜0.05为条件，通过筛选其中P值较小的前10个生物功能条目得到的富集分析结果图，柱体颜色越红，富集程度就越高；矩形柱体越长，参与基因就越多。在GO?BP富集分析过程中，车前草主要参与氧化应激反应（response to oxidative stress）、细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）等生物过程；在GO?CC富集分析中，包含膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）等10个条目；在GO?MF富集分析中，车前草主要参与RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等生物功能过程。图5是以P<0.05为条件，通过筛选P值较小的前30条信号通路所得的KEGG通路富集分析气泡图。圈体颜色越红，富集程度越高；圈体面积越大，参与基因越多。由图5可知，交集基因主要集中在PI3K-Akt信号通路（P13K-Akt signaling pathway）、流体剪切应力（Fluid shear stress and atherosclerosis）与癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等信号通路中。这几条通路最有可能是车前草治疗隐匿性肾炎的信号通路。TP53、AKT1、VEGFA等核心基因主要分布在以上信号通路中，通过调控不同的信号通路达到治疗隐匿性肾炎的目的。GO富集分析结果显示，上述核心基因可能通过氧化应激反应、活性氧代谢过程、细胞因子受体结合、蛋白酪氨酸激酶活性等生物功能过程达到抗隐匿性肾炎的目的。研究发现可调节表皮生长因子受体酪氨酸激酶，抑制血管紧张素Ⅱ介导的损失，从而维系肾小球滤过屏障［22］。KEGG通路富集分析结果表明，车前草治疗隐匿性肾炎的核心基因主要集中在PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、癌症中的蛋白多糖等信号通路。PI3K-Akt信号通路的失活和糖尿病肾病中CTGF表达的抑制相关，进而减轻肾细胞外基质积聚，从而抑制患者肾脏恶变进程［23］。综上所述，PPI网络中的核心基因主要是参与多种生物功能过程，协调多条信号通路达到治疗隐匿性肾炎的目的。2.6 分子对接使用Vina对接模拟将活性成分和蛋白进行分子对接并计算结合能， 设置参数为center（x，y，z）=（0.666 7，0.306，0.917）、size（x，y，z）=（36，52，26）、energy-range=5，num-modes=20筛选度值大小前4位的活性化合物与AKT1、VEGFA、TP53进行分子对接，结果如表3和图6所示。普遍认为配体与受体结合时能量越低越稳固，发挥的作用越大。表3结果显示，4种活性化合物与AKT1、TP53、VEGFA的结合能均较低，其中VEGFA的结合能稍大于TP53和AKT1，说明其在治疗隐匿性肾炎的过程中发挥的作用稍弱于TP53和AKT1，这与度值分析结果不谋而合。图6根据结合能分析结果，筛选具有最低结合能的化合物蛋白组合进行分子对接模拟，从分子结构层面验证网络药理学的分析结果。为了进一步了解车前草治疗隐匿性肾炎的作用机制，通过分子对接模拟结果可知，黄岑素、木犀草素、豆甾醇、棕榈酸豆甾醇醋、β-谷甾醇棕榈酰酯能与TP53、AKT1、VEGFA自由结合，且其结合能均较低，其中黄岑素、豆甾醇、木犀草素等黄酮、甾体类化合物与VEGFA、AKT1、TP53的结合能最低，说明在车前草治疗隐匿性肾炎的过程中，主要是通过黄铜和甾体类化合物协同VEGFA、AKT1、TP53等核心基因，参与多条信号通路从而达到治疗隐匿性肾炎的目的，这与网络药理学的分析结果不谋而合。3 结 论隐匿性肾炎患者发病隐匿，病情加深会引发尿毒症，严重威胁患者生命安全。上海市名中医叶景华从事60余年的临床肾病研究认为，该病的主要病因源于热与虚，临床上常采用琥珀、三七等活血化瘀和具有利尿功效的药物［5， 24］。而车前草不仅具有同样的利尿功效，相比与琥珀、三七等名贵中药材，车前草具有产量大，成本低的优势。故本研究利用网络药理学的研究模式，通过TCMSP数据库共筛选得到8种车前草有效成分，以Degree值筛选β-sitosteryl palmitate、stigmasteryl palmitate、木犀草素、黄岑素为主要活性成分。木犀草素可通过调控多种信号通路诱导肿瘤坏死因子的生成，从而发挥其抗肿瘤的药理作用［25］。黄岑素发挥抗肿瘤作用机制多样，可通过诱导细胞凋亡达到治疗的目的［26］。再通过PPI网络分析发现TP53、VEGFA、AKT1等核心基因最有可能是治疗隐匿性肾炎的核心基因。最后通过GO富集分析和KEGG通路富集分析发现车前草中的核心基因可能通过参与蛋白酪氨酸激酶等生物功能过程，协同参与PI3K-Akt信号通路达到治疗隐匿性肾炎的目的。本研究利用网络药理学的方法，结合相关的临床药理研究，对车前草治疗隐匿性肾炎的作用机制进行初步探讨。研究结果初步表明车前草相关活性成分，通过参与相关生物学通路和过程治疗隐匿性肾炎，但具体结果仍需要相关实验进行证明。