《武汉工程大学学报》 2018年04期
360-365
出版日期：2018-08-23
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
小菜蛾GluClR同源模建及与阿维菌素类化合物的对接
阿维菌素是通过土壤放线菌发酵得到的大环内酯类药物（图1），这种药物从根本上降低了河盲症和淋巴丝虫病的发病率，对其它寄生虫疾病也有出色的防控效果，发明该化合物的美国科学家威廉·C·坎贝尔、日本科学家大村智于 2015年获得诺贝尔生理学及医学奖。阿维菌素类化合物在防治农业害虫方面也有突出的效果，特别是对小菜蛾、甜菜夜蛾等难防治的害虫也具有突出的防效。研究表明阿维菌素类化合物作用于谷氨酸门控氯离子通道受体（glutamate-gated chloride ion channel receptor， GluClR）， GluClR与甘氨酸受体（glycine receptor， GlyR）、[γ]-氨基丁酸受体（GABAAR、GABACR）、及组氨酸门控氯离子通道受体（histidine-gated chloride ion channel receptor， HisClR）同属于抑制性阴离子通道受体，是半胱氨酸环配体门控离子通道受体超家族中的重要一大类，具有重要的研究价值。该家族的成员还包括烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor， nAChR）、5-羟色胺3受体（5-hydroxytryptamine type3 receptor， 5-HT3R）等激动性阳离子通道受体［1］。研究表明，GluClR仅在无脊椎动物和软体动物神经及肌肉细胞中被发现。GluClR介导快速的突触传递抑制效应，调节细胞及机体功能［2］，与哺乳动物受体比较，GluClR是研发安全、高效杀虫剂的重要靶标。
无脊椎动物体内的GluClR 通道均是由像花瓣一样的五个亚基组成，每个亚基均含有胞内区、跨膜区及胞外区［3-6］。目前，还未见报道小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR受体的三维结构实测结果， 本研究采用同源模建的方法，以实验解析得到的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）GluClR蛋白三维结构为模板（PDB：3RHW），构建小菜蛾GluClR结构模型，并将阿维菌素类化合物与其进行对接并与实测活性比较，研究安全、高效、对人、畜、环境安全，对害虫活性高的阿维菌素类衍生物提供理论依据。
1 实验部分
1.1 同源模建
通过搜寻PDB数据库，未发现已经解析得到的小菜蛾GluClR三维结构，但在该数据库中寻找发现了一个已经解析的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的GluClR三维结构（PDB ID：3RHW at 0.326 nm），可以作为模板。本研究以解析得到的秀丽隐杆线虫的GluClR三维结构为同源模建的模板，采用同源模建的方法构建昆虫小菜蛾GluClR的三维结构，在模型优化的基础上进行分子对接研究。
1.2 选择模板
模建成功的关键是选择合适的模板，模板蛋白的选择是否合适将直接影响同源模建获得的最终结果，综合分析模板受体蛋白家族的同源性、完整性及分辨率等因素，最终选择线虫（Caenorhabditis elegans）的三维结构蛋白（PDB ID：3RHW at 0.326 nm）作为模板。
1.3 选择序列
为构建目标蛋白GluClR的三维结构，通过Swiss-Prot/TrEMBL搜寻， 得到了比较合适的小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR蛋白序列（GI：397310811）。通过对模板及构建序列进行比对及合理编辑，去除与本研究无关的部分膜外区残基。
1.4 亚基构建
通过在SYBYL-X 2.0程序包的Biopolymer模块中采用Needleman & Wunsch方法，将线虫（Caenorhabditis elegans）模板序列与昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）目标蛋白序列进行序列比对生成多序列对比文件后，在ORCHESTRAR模块中导入MSF文件，进行识别并构建结构保守区、结构可变区，添加侧链等［7-8］。
1.5 亚基组合
GluClR为同源五聚体结构蛋白，因此，将所构建的亚基依次按一定顺序一一对应叠合到模板的5个亚基上并使用MERGE模块完成亚基的组合即可。
1.6 模型优化
使用分子力学及分子动力学对所构建的小菜蛾GluClR 三维结构进行优化和修正，使模建得到的GluClR三维结构具有合理性，可以进行下一步研究。首先在AMBER FF99力场下采用共轭梯度法（Cojugate Gradient Method）进行体系的能量优化，使能量梯度最后收敛值小于5 kcal·nm/mol，在此基础上进行分子动力学模拟（dynamics simulatioin），其中设定300 K恒温，1.01×105 Pa压力，1 fs步长，弛豫1 000 ps进行计算，最终检验模型的稳定性。
1.7 分子对接
分子对接过程的关键是选择合理的受体结合模式，这将直接影响对接结果。本研究参考模板配体与受体结合位点，采用自定义氨基酸残基模式确定受体结合口袋。在SYBYL-X 2.0程序包的Surflex-docking模块中［9-10］，使用原型分子（protomol）为结合口袋，参数Bloat值和Threshold值确定其结合口袋形状及大小［11］。
将阿维菌素、伊维菌素、埃玛菌素分别与同源模建得到的小菜蛾GluClR三维结构进行对接，研究通过生物发酵得到的杀虫剂阿维菌素及其衍生物与昆虫小菜蛾GluClR的相互作用模式及作用机理。
2 结果与讨论
2.1 同源模建
昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR的亚基序列（GI：397310811）与作为模板的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）GluClRA链序列的序列比对结果如图2所示。小菜蛾GluClR序列与丽隐杆线虫模板序列相似度较高，二者序列同源性为65.12%，而模建研究表明，一般情况下，模板蛋白序列与构建的目标蛋白序列同源性大于30%时，即可以通过同源模建方法获得可靠的目标蛋白三维结构模型［12］。在本研究中，针对同源模建昆虫小菜蛾的GluClR三维结构的目的，采用秀丽隐杆线虫GluClR的三维结构蛋白作为模板是合理可行的。
通过分析，秀丽隐杆线虫的GluClR为同源五聚体组成的离子通道蛋白受体，5个亚基序列一致。通过二者序列比对、构建结构保守区、结构可变区、侧链和模型优化后，获得了GluClR其中1个亚基，将模建所得的小菜蛾GluClR亚基分别叠合到编辑之后的模板的亚基上，组装成为昆虫小菜蛾的GluClR三维结构模型，结构如图3（a）所示。
相对于同源模建获得的模型，还需对其结构进行分子力学及分子动力学研究［13］。在能量优化方面，使用了SYBYL-X 2.0软件包中的Dynamics模块对其进行分子动力学模拟，同源模建所获得的昆虫小菜蛾GluClR三维结构的势能在10 ps之后逐渐趋于稳定在9 000 kcal/mol左右； 昆虫小菜蛾GluClR三维结构骨架原子的位置相对于模型最初构象的均方根差 （root mean square deviations， RMSD） 在昆虫小菜蛾三维结构模型中的RMSD值在最初阶段逐渐上升，在200 ps之后，RMSD值稳定在0.55 nm左右，表明体系已趋于稳定，说明该模型在能量上是合理的。在构象研究方面，采用SYBYL-X 2.0程序中的Protein Analyze模块内Ramachandran Plot对同源模建所得到的昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）GluClR三维结构模型的构象进行验证，结果如图3（b）所示，拉氏图Ramachandran Plot是组成蛋白质的氨基酸残基理论上可以出现的构象，检测同源模建模型的质量［11］。本研究中模建所获得的昆虫小菜蛾GluClR的三维结构模型的全部氨基酸残基均处于允许区域内，证明该模型在构象上也是合理的，完全可以用于分子对接的下一步研究。
2.2 分子对接
参照文献报道采用残基模式定义结合口袋［14］，残基中包括A链的Tyr4，Leu6，Ile7，Gln8，Ile11，Pro12，Met15，Gln48及E链的Ala46， Ser50，Asn53，Asp66，Val67，Ter69，Gly70，Leu73， Phe77，在Surflex-docking模块下，活性位点被称为protomol，threshold与bloat为默认值［11］。
采用SYBYL-X 2.0程序中的Surflex-docking模块进行分子对接研究，cscore模块会分别对3个配体（EMA、IVM、AVM）与模建得到的受体对接结果分别进行打分，评价对接结果。最终的总打分将以-lg10Kd的形式给出，Kd为配体的解离常数。结合自由能与Kd的关系如下：
Free Energy of Binding = RTlnKd
从以上3个化合物与小菜蛾GluClR的对接结果来看，Total Score值从高到低依次为埃玛菌素（9.60）、伊维菌素（9.33）、阿维菌素（8.59），其模拟结果与该类化合物实测对小菜蛾的触杀致死率埃玛菌素（0.33 mg/g）、伊维菌素（0.39 mg/g）、阿维菌素（0.56 mg/g）一致［15］，如表1所示。
埃玛菌素、伊维菌素、阿维菌素与小菜蛾GluCl的对接位点及结合模式如图4所示。
图4表明，阿维菌素类化合物（EMA、IVM、AVM）与昆虫小菜蛾GluClR的对接模式相似，都是如“楔子”一般嵌入到昆虫小菜蛾GluClR的相邻亚基的TM1和TM3之间的靠近外膜区空隙，并且都是二糖部分完全嵌入空隙之内，如图4所示，埃玛菌素（EMA）与小菜蛾GluClR的对接中，由于二糖部分甲氨基的引入，使氨基氢与E/SER50的羟基氧形成氢键，另外，氨基旁四氢吡喃环上O与E/SER49侧链羟基H形成氢键［图 4（a）］。伊维菌素（IVM）与该受体的对接中二糖部分末端羟基H 与E/SER50侧链羟基O形成氢键，二糖部分末端羟基H与E/ALA46骨架羰基O形成氢键［图4（b）］。而在阿维菌素（AVM）与该受体的对接中仅有二糖部分末端羟基H与 E/SER50侧链羟基O形成氢键［图4（c）］。Total Score值从高到低依次为埃玛菌素（9.60）、伊维菌素（9.33）、阿维菌素（8.59），其中埃玛菌素与伊维菌素打分相近且明显大于阿维菌素，其结果与该类化合物对小菜蛾的触杀致死率埃玛菌素（0.33 mg/g）、伊维菌素（0.39 mg/g）、阿维菌素（0.56 mg/g）的实测活性一致［15］。
3 结 语
本研究以文献报道的实验解析得到的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）谷氨酸门控氯离子通道为模板，同源模建了昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）氯离子通道受体三维结构， 经分子力学及分子动力学研究， 证明模型的合理性。将模建获得的小菜蛾氯离子通道受体与阿维菌素类衍生物埃玛菌素、伊维菌素和阿维菌素分别进行分子对接，发现对接打分结果与实测杀虫结果一致。研究结果可为了解作用于GluClR杀虫剂的作用机理及设计用于该受体的杀虫剂提供理论依据。