《武汉工程大学学报》  2018年02期 119-126   出版日期：2018-05-17   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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环境中五氯酚对水生生物的毒理学研究进展


　概　述1.1　水环境中PCP的分布PCP已经成为典型的持久性有机污染物（persistent organic pollutants，POPs）的一种，在水环境中PCP污染普遍存在。Zheng等［11］为了研究PCP在不同地区的污染情况，对水环境中PCP的浓度及分布状况做了调查和研究，研究结果显示在20世纪70年代这个时期，西方大部分国家的水环境中PCP含量都较高，但是在20世纪末期这些国家的水环境中的PCP含量开始逐渐的下降，这都是源于各个国家对PCP使用禁令的颁布。与这些国家相反的是，我国的地表层水和沉积物中的PCP的浓度依然在逐年升高。洞庭湖位于中国南部，湖面总面积约2 740 km2。湖深平均约6 m~7 m，最深的湖达31 m。这是中国淡水鱼的重要来源。然而，血吸虫在这个地区长期存在。1960年为了控制通过钉螺传播的血吸虫病，喷洒了大量的五氯酚钠（Na-PCP）。据估计，在该地区使用至少9.8 ×106 kg的Na-PCP，洞庭湖中PCP的含量曾高达103.7 μg/L［12］。尽管如此，自1996年以来，这一地区钉螺有减少，血吸虫病得到一定程度上的控制，但仍有大量Na-PCP、PCP分布在湖泊环境中并积累在沉积物中［13］。PCP及其衍生物的持久性导致湖泊严重污染。胡建英等［14］对海河流域以及渤海湾水体和沉积物中PCP的污染状况展开了调查，研究发现海河流域和渤海湾水体PCP浓度范围分别为0 μg/L~1.8 μg/L和0 μg/L~0.3 μg/L，而在沉积物中PCP的质量浓度分别为0 ng/g~13.7 ng/g和0 ng/g~0.04 μg/kg。有研究表明，长江流域曾长期使用PCP杀灭钉螺，长江南京段沉积物中PCP含量为0.49 μg/kg~4.57 μg/kg［15］。在中国珠三角，河流沉积物中PCP的平均含量为7.93 ng/g。研究发现，中山鱼塘沉积物中PCP含量最高（平均约为37.5 ng/g），其次是东莞（平均21.1 ng/g），在深圳（平均约3.69 ng/g）和顺德（平均约2.20 ng/g）则较少［16］。1.2　PCP在水生生物体内的蓄积PCP具有较高的生物蓄积性，难降解，水环境中残留的PCP将大量富集在水生生物体内，PCP及其Na盐可以经过生物体表层肌肤、呼吸道、消化道吸收，在生物体的肝、肾中含量较高，在脂肪、肌肉和脑中的含量较少。因此，PCP在水生生物体内的浓度可以直接反映水环境受PCP的污染情况。生物富集系数（bioconcentration factors，BCF）用来表示污染物在生物体内的生物富集作用的大小，是描述污染物在生物体内累积趋势的重要指标。Tachikawa等［17］将淡水青鳉鱼和海水青鳉鱼暴露在一定浓度的PCP中，结果显示淡水青鳉鱼和海水青鳉鱼的BCF值分别为1 680和370，该研究发现盐度可以影响PCP在青鳉鱼体内的富集大小。Kondo等［18］研究发现青鳉鱼体内的PCP浓度与其在水环境中的浓度呈负相关，鱼体内的PCP浓度随其在水环境中的降低而增加，同时，他们的研究也发现PCP在鱼体中累积能力较2，4-DCP（2，4-二氯苯酚）和2，4，6-TCP（2，4，6-三氯酚）更高，且PCP对青鳉的BCFs值随着水体的pH的增大而减小。据报道，当水体中pH从9降低到5.5时，金鱼体内PCP的生物富集因子从10增加到125［19］。因此，在评估PCP对水生环境的不利影响时，必须考虑水的pH值。研究发现暴露在含PCP水溶液中48 h后，鲫鱼胆囊对PCP的富集系数高达11 365。PCP会在草鱼胆汁内大量积累，并且90%以上为结合态，暴露时间越长，PCP浓度增加，48 h残留量达到904 mg/kg，BCF为6 027［20］。在2003年至2004年期间，Ge等［21］在江苏省收集的55种鱼，虾，螃蟹，青蛙和海龟等样品，测定样品体中PCP浓度。PCP浓度范围从小于方法检测限（method detection limit，MDL）0.5 μg/kg 至61 μg/kg（以单位湿重计），江苏省55个样本PCP浓度平均值为5.2 μg/kg。许晓国等［22］研究了江苏常州市金坛区的鱼塘，发现在使用过PCP的水体中，PCP在鱼肉中平均残留度为0.22 μg/kg，最高为0.35 μg/kg（以单位干重计），在鱼胆汁中平均残留度为94.19 μg/L，最高达167.30 μg/L，高于没有使用过PCP的鱼塘鱼肉和胆汁中PCP的残留度。2　PCP对水生生物的作用机制和毒性效应2.1　氧化损伤目前，关于PCP对水生生物的氧化损伤毒性效应研究有很多，利用PCP引起的机体生化效应的改变作为敏感的生物指标（生物标志物），来评价PCP毒性，从而进一步为环境监测，提供科学依据。李伟民等［23］以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase?，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH）、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等为生物指标，研究了PCP对鲫鱼肝脏的氧化损伤，在暴露低浓度（0.016 mg/L）的PCP溶液15 d后，观察发现在鲫鱼肝细胞中MDA含量提高，SOD活性和GSH含量均降低，表明PCP造成了鲫鱼肝脏的氧化损伤效应。类似的，张民等［24］通过细胞体外毒性实验，发现PCP对鲫鱼血液淋巴细胞会造成毒性影响，在PCP浓度为500 μg/L、1 000 μg/L分别暴露，暴露结果发现乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）相对释放量显著性增加，LDH释放量与五氯酚浓度及暴露时间呈正相关，LDH可作为研究PCP对鲫鱼细胞毒性的指标。一些实验室为研究PCP对肝细胞氧化损伤和凋亡的影响，采用鲫鱼肝细胞原代培养模型，实验结果表明PCP使得鲫鱼肝脏细胞MDA含量上升的同时也会导致鲫鱼肝细胞中GSH含量发生下降，细胞内ROS（活性氧，早已被认为是破坏代谢的副产物）显著增加，这表明了PCP会通过影响活性氧ROS的含量来诱导肝脏细胞出现凋亡［25］。王辅明等［26］为筛选检测低浓度五氯酚对水生生物毒性效应较敏感的指标，研究了PCP对鮈鲫的SOD、GSH、热激蛋白（heat?shock?protein，HSP）70活性的影响。在相同暴露时间下，随着PCP暴露浓度的不断增大，SOD的活性呈现出先受抑制后被激活的趋势，GSH和HSP70的含量则无明显变化；在相同暴露浓度下，SOD的活性随PCP暴露时间的延长也表现为开始被激活后又被抑制的趋势，GSH和HSP70的含量则无明显变化。所以，低浓度PCP暴露下与GSH、HSP70的含量相比，SOD的活性更好地反映了PCP对鮈鲫幼鱼的氧化损伤效应，说明SOD的活性可作为评价低浓度PCP对水生生物毒性效应的指标。Luo等［27］利用电子顺磁共振技术，发现鲫鱼在PCP暴露后可以诱导鲫鱼肝脏内产生羟基自由基，并且PCP浓度与羟基自由基之间存在浓度效应关系，在0.05 mg/L PCP染毒7天后，谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值与对照组相比有明显下降趋势，说明PCP可以导致鲫鱼体内产生氧化应激反应。房彦军等［28］通过蛋白质组学的研究发现，存在39个差异表达蛋白可能与PCP肝脏毒性效应有关的，并应用质谱鉴定技术（mass spectrometry，MS）对其中18个差异蛋白进行了鉴定。这些差异蛋白主要体现在脂类代谢与转运、线粒体能量代谢和氧化应激等生物学过程当中，这些蛋白都能作为稀有鮈鲫肝脏毒性效应的标志物。2.2　急性毒性效应PCP属于环境激素类物质［29］，对大多数鱼类，PCP都有很强的毒性。例如，Johnson等［30］研究表明PCP对斑点叉尾鮰、虹鳟、太阳鱼、黑头软口鲦、大马哈鱼的96h半数致死浓度（LC50）分别为68 μg/L、52 μg/L、32 μg/L、205 μg/L和68 μg/L。Min等［31］研究发现，PCP对细鳞斜颌鲴和青鱼的96 h的LC50值分别为0.09 mg/L和0.10 mg/L。洪华嫦等［32］研究了不同质量浓度的PCP对斜生栅藻的毒性效应，结果表明在暴露24 h，48 h，72 h，96 h和120 h后PCP对斜生栅藻的半最大效应浓度（EC50）分别为0.883 mg/L，0.283 mg/L，0.225 mg/L，0.168 mg/L和0.192 mg/L，并且PCP质量浓度越高斜生栅藻生长受抑制程度越强，当PCP的质量浓度超0. 50 mg/L时，斜生栅藻的生长基本完全受到抑制。2005年，郑敏等［33］用PCP染毒斑马鱼来进行胚胎发育毒性效应研究。研究结果显示PCP对发育不超过6 h的斑马鱼胚胎具有明显的抑制效应，可以导致胚胎畸形发育甚至是发育终止。斑马鱼胚胎的致死效应敏感强度随着 PCP对发育48 h斑马鱼胚胎作用时间的增长而增大。其中，LC50值最小的是0 hpf（hours past fertilization ，hpf）组，为70.8 μg/L；LC50值最大是24 hpf组，为831.8 μg/L。潘建林等［34］研究发现PCP对小虾的24 h和48 h的LC50分别为80 mg/L和67.5 mg/L，并且PCP对大虾的24 h和48 h的LC50分别为750 mg/L和500 mg/L。有研究报道，五氯酚对花翅羽摇蚊幼虫96 h及10 d的LC50分别为20.6 mg/kg和12.5 mg/kg ［35］。2.3　内分泌干扰PCP的激素作用影响水生生物的繁殖、发育和生长，并且PCP不易被氧化，易富积在生物体内，对水生生物具有很强内分泌干扰效应，会导致水生生物生长畸形，并影响后代繁殖及发育［36］。2.3.1　生殖毒性　佟钰杰等［37］进行PCP对大型溞蜕皮影响的实验，来研究PCP的环境激素作用，结果表明PCP可抑制大型溞的蜕皮过程，使大型溞蜕皮时间延长。0.01mg/L PCP染毒大型溞48 h，摄食率会受到显著的抑制［38］。有研究发现，如果将离体培养的斑点叉尾鮰肝脏细胞暴露于PCP中，卵黄蛋白原（vitellogenin，VTG）在雄鱼肝脏细胞中的表达将会增加，这个研究发现表明了PCP可能具有潜在的内分泌干扰效应［39］。类似的研究还有，如对日本青鳉进行PCP染毒试验，经过28 d暴露试验，日本青鳉体内的芳烃受体活性、雌激素受体活性以及繁殖行为都会受到PCP的影响。在200 μg/L PCP以下浓度暴露28 d后，日本青鳉雌鱼血液中的VTG含量水平和雌鱼的产卵量均有所降低，而雄鱼血液中VTG明显提高［40］。Zha等［40］研究发现PCP染毒日本青鳉能引起雌激素受体和芳香烃受体激活一致的效应，将100 μg/L PCP染毒超过2周时，雌性青鳉的产卵能力和平均繁殖力会发生显著下降，在F1代时，200 μg/L PCP影响了后代的孵化率和孵化期，会造成了严重的生殖损害。研究发现，在0.01 mg/L PCP暴露下，青鱼生长率为52. 0%，与对照组相比其生长率稍有减小，但并无显著性的差异。当暴露浓度增加到0.02 mg/L PCP时，其生长率明显下降到42.5%，当暴露浓度最高达到0.08 mg/L PCP时，其生长率仅为14.2%［41］。2.3.2　甲状腺毒性　在20世纪90年代，研究显示PCP有潜在甲状腺破坏作用［42］。Schwarz等［43］研究发现，在PCP暴露下，会引起鲤鱼体内的甲状腺激素（T3和T4）水平产生显著的变化，激素含量水平的变化会干扰到鲤鱼的甲状腺内分泌系统。研究进一步发现，相比于T4，PCP与甲状腺转运蛋白TTR更易结合，PCP的这种结合能力会导致到达靶器官和靶细胞的甲状腺激素水平降低［44］。Schuur等［45］研究发现，PCP会对脱碘磺基转移酶的活性产生影响，其作用机理是通过抑制碘甲状腺原氨酸的硫酸化，对甲状腺激素的正常代谢产生影响。有研究发现，慢性暴露于低浓度PCP的水环境中会改变斑马鱼血浆甲状腺激素水平，以及下丘脑-垂体-甲状腺轴和斑马鱼肝脏中甲状腺激素信号传导和代谢相关基因的表达，导致斑马鱼发育异常［46］。2.4　遗传毒性有研究发现，在PCP暴露下，PCP会造成鲶鱼染色体出现结构性损伤，例如染色单体呈现出断裂、偏离中心、环状以及非整倍构造。这表明PCP对水生生物有一定的遗传毒性作用［47］。Pavlica 等［48］利用微核法研究PCP分别对鹦鹉螺蜗牛和斑马贻贝的基因毒性时发现，PCP可以造成鹦鹉螺蜗牛和斑马贻贝非常明显的微核率。并且，当PCP≥80 μg/L时对斑状贝DNA损伤明显增加［49］。与此同时，Farah等［50］研究证实了PCP和2，4-二氯酚（2，4-Dichlorophenol ，即2，4-DCP）同样具有遗传毒性，暴露在这两种有机污染物中，都会诱导斑点叉尾鮰微核频率。并且PCP的毒性要高于2，4-DCP。2006年， Zhao等［51］以卵黄蛋白原作为标志物，利用幼年金鱼肝细胞原代培养来研究PCP和TCDD（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，四氯二苯并-p-二噁英）的抗雌激素效应。研究发现PCP和TCDD可能会与雌二醇竞争性结合雌激素受体，从而干扰卵黄蛋白原表达，对金鱼幼体有显著的遗传毒性。并且，采用五氯酚及其钠盐对鲤鱼肾细胞DNA体内和体外进行染毒实验发现，处理组尾距、慧尾长、Olive尾距、慧尾长DNA均高于对照组［52］。马永鹏等［53］根据PCP对稀有鮈鲫血细胞和肝细胞DNA的影响的研究发现，PCP会破坏稀有鮈鲫血细胞和肝细胞DNA结构，使其出现断裂、迁移，并且会明显损伤其血细胞和肝细胞DNA。研究表明，当暴露于含有PCP水环境中时，PCP的浓度越高，PCP对稀有鮈鲫胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA的诱导性表达影响越大，基因被诱导的程度越大，该结果说明CYP1A基因和p53基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的敏感指标［54］。2.5　细胞毒性国内外许多文献已经表明PCP对水生生物具有细胞毒性。例如，Dimich等［55-57］对鲫鱼肝细胞进行体外毒性试验，将鲫鱼肝细胞暴露在低浓度PCP下并观察不同浓度范围对鲫鱼肝细胞的毒性影响。结果表明，暴露在2.5 μg/L~100.0 μg/L PCP下，PCP对鲫鱼肝细胞的活性没有显著性的效应，但暴露在500.0 μg/L~1 000.0 μg/L PCP范围内时，对肝细胞膜的完整性产生明显的影响，说明PCP对鲫鱼肝细胞具有一定的毒性效应。张民等［58］研究了PCP对鲫鱼血液中淋巴细胞毒性作用。结果发现在500 μg/L和1 000 μg/L PCP暴露下， LDH相对释放量明显有所增加，这表明PCP破坏了鲫鱼血液淋巴细胞的完整性。房彦军等［59］将稀有鮈鲫肝细胞暴露在PCP中，透射电镜检测结果证实，无论是低浓度或高浓度暴露组，肝脏细胞核都产生严重损伤，核仁会扩大，线粒体等细胞器遭到严重损坏，脂滴大量产生且变大。PCP会显著抑制稀有鮈鲫肝细胞的正常生长，且会损伤肝细胞DNA，由此可知PCP具有明显的肝细胞毒性。Waneene等［60］进行了雄性鲶鱼肝细胞的体外培养实验，并利用荧光素二乙酸酯测定（fluorescein diacetate，?FDA）来评估细胞活力，并用Western Blot分析来评估暴露PCP后的卵黄发生素的表达。从该实验获得的数据表明PCP的细胞毒性作用有较强的剂量-反应关系。在PCP中暴露48 h后，PCP导致细胞活力降低50％所需的剂量（LD50）计算为1.987 μg /mL。Constanze等［61］用虹鳟肝细胞（RTL-W1）来评价PCP及其代谢物四氯氢醌?（tetrachlorohydroquinone，TCHQ）体外细胞毒性作用机制，研究发现在一定程度上抗氧化剂（如抗坏血酸和槲皮素）能够减弱PCP和TCHQ的细胞毒性作用，但特别是在较高的PCP和TCHQ浓度下，抗坏血酸和槲皮素对细胞的不利影响会增大。2.6　胚胎、子代发育毒性水生生物体对外部刺激的敏感性在整个生命周期中都有所不同，特别是对于鱼类，胚胎和幼鱼阶段通常是生命周期中最敏感的时期［62］。Owens等［63］通过对青鳉的胚胎发育实验研究发现，PCP会使得青鳉心血管发育畸形，每颗卵1 250 纳克的剂量的PCP就能将90%的胚胎致死。刘红玲等［64］研究了PCP对斑马鱼胚胎发育影响，结果表明在0 hpf和24 hpf染毒试验，在48 h时五氯酚对斑马鱼胚胎都表现出最大的毒性，浓度越高，胚胎发育受抑制的现象越明显。类似地，有研究也表明PCP会在大马哈鱼组织中积累，并且能够影响和改变发育中的胚胎的生理学［65］。郑敏等［66］采用了斑马鱼胚胎发育技术，对PCP的胚胎进行染毒试验。结果证实PCP会抑制斑马鱼胚胎发育，会造成胚胎发育的畸形、死亡。Yin等［67］的研究表明在短期低浓度PCP暴露下，斑马鱼胚胎发育会产生畸形、死亡的原因之一，可能是PCP对斑马鱼胚胎发育产生抑制作用，增大了斑马鱼肝细胞中p53基因的点突变率。蒋琳等［68］将斑马鱼作为研究对象，对其进行胚胎发育毒性测试，发现暴露在1 000 μg/L PCP下，斑马鱼胚胎发育显著受阻，孵化率几乎为零。熊力等［69］采用稀有鮈鲫的胚胎作为研究材料，观察在PCP暴露下引起的胚胎发育变化，结果表明在PCP暴露下，稀有鮈鲫胚胎发育会延迟，并造成稀有鮈鲫多种畸形，如：脊柱弯曲、心包囊肿、胚胎卵凝结以及死亡等现象。该研究选择CYP1A基因和抑癌基因p53作为生物标志物，为进一步在分子水平上探讨PCP的胚胎毒性作用机制提供了基础。Ting等［70］为了探索PCP对早期发育的影响和潜在机制，将斑马鱼胚胎暴露于浓度为0，20 μg/L和50 μg / L的PCP，之后又进行了显微镜观察和cDNA微阵列分析。研究结果表明，在胚胎发育初期PCP对斑马鱼胚胎产生类似Warburg效应，受影响的胚胎具有发育迟缓的现象。2.7　其他PCP对水生生物还具有免疫毒性、致癌性、致突变性等毒性效应［71］。Chen等［72］研究发现，在PCP暴露下会降低鲫鱼血清中的免疫球蛋白M（IgM）的质量浓度，并产生很强的免疫毒性。这种继发性效应可能是由于PCP的内分泌干扰效应造成的。近几年，有关PCP致癌性对哺乳动物的研究比对鱼类的研究多，且主要是关于PCP的致癌性和鱼类p53基因表达量的相关性研究。Zhao等［73］发现了斑马鱼的p53基因信号通路和人类调控机制类似。徐韵等［74］微核试验和斑马鱼胚胎发育试验表明，PCP-Na具有一定的致突变性。聂晶磊等［75］还研究发现PCP对金鱼的Na+-K+-ATPase具有抑制作用，且有浓度依赖性，PCP浓度升高，抑制强度加大。Preston等［76］研究了PCP对萼花臂尾轮虫（B.calyciflorus）的毒性作用，发现急性毒性LC50和繁殖毒性EC50值在静水条件下分别从738 μg/L和1 082 μg/L减小到在流水条件下262 μg/L和136 μg/L。3　结　语综上所述，PCP是具有POPs特性的化合物，能在水环境中长期残留，并在水生生物体内大量累积，对生物体产生毒害作用，并最终经食物链危及到人类的健康。但目前，有关PCP及其代谢物对水生生物体的毒性效应和危害的研究，主要集中在一些浮游生物及鱼类，而对于水环境中底栖生物的研究，较少见到相关报道。有限的研究大多数停留在组织、器官等整体水平，而在细胞水平和分子水平的深入研究有限，其致毒机理与作用机制还有待进一步研究。因此有关PCP的水生态毒理学效应，还有待于进一步研究。本实验室将以底栖生物如夹杂带丝蚓及我国特有的鲤科实验鱼种稀有鮈鲫等为实验模型，进一步研究PCP对水生生物的毒理学效应及作用机制。