《武汉工程大学学报》 2016年3期
266-230
出版日期：2016-06-22
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
纳米氧化铜与庆大霉素协同抗MRSA作用的研究
1 引 言由于抗生素的广泛使用甚至滥用，许多细菌对抗生素产生耐药性，使得抗生素的使用遇到瓶颈，开发新的能有效对抗耐药菌的药物迫在眉睫［1-3］. 近年来随着人们对纳米材料抗菌作用及机理的研究不断深入，人们发现纳米材料通过多种途径作用于细菌，使细菌不易产生耐药性［4］. 在无机纳米抗菌材料中，纳米银由于具有较强的抗菌作用被广泛研究和使用，但纳米银对人体及环境都具有较强毒性，人们开始将目光转向毒性较低的金属氧化物，如纳米氧化锌、氧化镁、氧化铜及二氧化钛等［5］，这些金属氧化物结构稳定、能长时间发挥抗菌作用. 其中，氧化铜是一种多功能的纳米材料，如用于储磁、能量转换、电极、电池及催化剂等，其价格比银低，化学物理性质稳定［6］，此外，纳米氧化铜对大肠杆菌、枯草杆菌、沙门杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等具有较好的抗菌活性［7-8］. 将纳米材料与抗生素联合抗菌，则纳米材料有可能破坏耐药菌对抗生素的耐药机制，使抗生素重新发挥抗菌作用. 目前有关纳米材料与抗生素协同抗菌作用研究报道较少，McShan［9］等报道新霉素与纳米银联用对鼠伤寒沙门氏菌 （Salmonella typhimurium）具有明显的协同抗菌效果，Luo［10］等报道纳米氧化锌和头孢曲松钠联合作用具有协同作用. 但有关氧化铜与抗生素的协同作用还未见报道. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （methicillin resistant Staphylococcus aureus， MRSA） 是临床最常见的耐药菌，MRSA感染会引起肺炎、伪膜性肠炎、败血症、脓毒血症等疾病发生，MRSA成为医院感染的重要病原菌之一［2］. 寻找能有效抗MRSA感染的抗生素与纳米材料组合，对治疗MRSA引起的感染具有重要意义. 本研究采用水热法合成纳米氧化铜，测定其与对MRSA具有显著耐药性的抗生素的联合抗菌效果，筛选具有协同抗菌作用的抗生素与纳米氧化铜组合，以期为抗MRSA感染的新药研发提供实验基础. 2 实验部分2.1 试剂与仪器金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus （S. aureus， ATCC 9118） 由华中科技大学生命科学学院提供； MRSA由武汉市第三人民医院提供. 醋酸铜 ［Cu（CH3COO）2］购自上海阿拉丁试剂有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） 试剂购自Sigma公司；庆大霉素 （GEN）、头孢呋辛 （CXM）、头孢噻肟 （CTX）、哌拉西林 （PIP）、环丙沙星 （CIP）、阿奇霉素 （AZI）、万古霉素 （VAN） 和复方新诺明 （SXT） 抗生素纸片购自Oxoid公司；硫酸庆大霉素 （Gentamicin Sulfate） 注射液购自宜昌人福药业有限公司，纯度 > 99.9%；Mueller-Hinton （MH） 培养基购自奥博星有限公司. 722E可见分光光度计，天津市普瑞仪器有限公司生产；D8 ADVANCE型X-射线衍射仪 （XRD），德国Bruker公司生产；S-4800 FEG型扫描电子显微镜 （SEM），日本Hitachi公司生产. 2.2 实验方法2.2.1 纳米氧化铜的合成与表征 将2 mmol的Cu（CH3COO）2 放入含30 mL HEPES溶液的50 mL圆底烧瓶中，调pH为10.4，将混合物搅拌并超声处理，直到Cu（CH3COO2） 完全溶解在HEPES溶液中. 然后将溶液倒入50 mL聚四氟乙烯反应釜，120 ℃反应6 h. 待反应釜冷却至室温后，离心，用去离子水洗涤5次，无水乙醇洗涤1次，60 ℃烘箱烘干，收集样品. 所制备的纳米氧化铜组分采用XRD进行表征，Cu Ka =0.154 06 nm，扫描范围为20~80°；利用SEM对纳米氧化铜的形貌及粒径分布进行表征，操作压力为5 kV. 2.2.2 抑菌圈测定 实验方法见参考文献［11］. 在MH固体培养基上均匀涂布100 mL 108 CFU/mL MRSA菌液，贴上抗生素纸片，35 ℃恒温培养18 h后，测量抑菌圈的直径. 为测定CuO与抗生素联用的抗菌活性，可在抗生素纸片上滴加10 mL 1 mg/mL CuO溶液，然后内贴在涂布菌液的固体培养基上，35 ℃恒温培养18 h后，测量抑菌圈的直径. 所有实验重复3次. 2.2.3 纳米氧化铜与抗生素联用的部分抑菌浓度指数（FIC）测定 采用稀释法测定CuO与GEN分别作用MRSA的最低抑菌浓度 （MIC）［12］. 将CuO与GEN在4×MIC到1/32×MIC抑菌浓度范围内分别倍比稀释成8个抑菌浓度，将不同抑菌浓度的两种抗菌药物按棋盘法设计［13］，两两组合加入试管，每种抗菌药物取0.5 mL，再将1 mL抑菌浓度为1×106 CFU/mL菌液与药物混合，35 ℃恒温培养18 h，记录澄清试管的两种抗菌药物的MIC值，按下式计算FIC指数. 以不加抗菌剂的试管作为空白对照，实验重复3次. FIC < 0.5，为协同作用；0.5 ≤FIC< 1，为部分协同作用；FIC =1.0，为相加作用；1