《武汉工程大学学报》 2015年09期
1-10
出版日期：2015-09-30
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
响应曲面法优化提取红景天苷和酪醇的工艺
０ 引 言红景天是景天科植物多年生木本或亚灌木野生植物，其干燥根是一种常见的中药. 其主要的药理成分为红景天苷和酪醇［１］. 具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、增强免疫力、抗高原反应等药理作用［２］. 吴少雄等［３］利用乙醇为溶剂，采用超声提取法提取大花红景天中的红景天苷. 王化田等［４］采用超临界ＣＯ２萃取红景天中的红景天苷和酪醇的研究. 何宝佳［５］等分别采用水、乙醇、甲醇作溶剂，研究了不同产地红景天中的红景天苷的提取工艺. 微波法是利用微波与介质的离子与偶极子分子的相互作用，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，导致细胞壁破裂，目标物溶出［６］. 具有减少提取时间、增加产物的回收率、提高产品质量、溶剂消耗少且无污染等优点［７］. 本实验采用微波辅助提取法进行红景天苷和酪醇的提取，在单因素的基础上，利用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应曲面分析建立数学模型，来优化提取工艺，提高红景天苷和酪醇的提取率. １ 实验部分１．１ 原料与试剂红景天根，无水乙醇，甲醇，磷酸，氢氧化钠，盐酸（均为分析纯），红景天苷标准品，酪醇标准品（成都曼斯特科技有限公司）. 图１ 红景天苷和酪醇结构图Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ mｏｌｅｃｕｌａｒ sｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ sａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ tｙｒｏｓｏｌ１．２ 实验仪器电子分析天平、ｐＨ计［梅特勒—托利多（上海）仪器有限公司］，１０１系电热鼓风干燥箱（南京制热干燥设备厂），微波合成／萃取反应器（上海新仪微波化学科技有限公司），循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂），Ａｇｌｉｅｎｔ１１００ 高效液相色谱（安捷伦科技有限公司）. １．３ 红景天苷和酪醇的提取工艺将红景天粉碎过筛，称取一定质量的红景天粉末于一定体积的溶剂中，经微波辐射一定时间后过滤，滤液为红景天提取液. １．４ 红景天苷和酪醇的含量检测采用高效液相色谱法检测红景天苷和酪醇的含量，色谱条件为：色谱柱ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流动相为甲醇∶质量分数０．５％磷酸水溶液（１５∶８５，Ｖ/Ｖ）；流速：０．８ ｍＬ/ｍｉｎ；检测波长２２４ ｎｍ；柱温：室温；进样量１０ μＬ. 分别配制质量浓度为０．３ ｍｇ/ｍＬ的红景天苷标准溶液以及０．０５４ ｍｇ／ｍＬ的酪醇标准溶液，用０．４５ μｍ微孔滤膜过滤. 标准曲线的绘制：分别进上述标准溶液２．０，４．０，６．０，８．０，１０．０ μＬ，再用所给的色谱条件进行测量，分别以标准品的进样量（ｍｇ）以及峰面积为横纵坐标来绘制标准曲线. 红景天苷标准曲线方程为：Ｙ＝１．４２７×１０６Ｘ＋１７．８４，Ｒ２＝０．９９９ ６；酪醇标准曲线方程为：Ｙ＝３．３４３×１０６Ｘ－６．８３９，Ｒ２＝０．９９９ ６. １．５ ｐＨ的测定方法及数据统计分析方法实验过程中溶剂的ｐＨ值测定方法是用ｐＨ计来测量，采用玻璃电极，用标准溶液进行二点法校准后使用. 实验数据统计分析方法是采用方差分析法进行分析. １．６ 单因素实验分别以不同溶剂（水、甲醇、乙醇）、不同ｐＨ值、微波温度、微波提取时间、固液比及药材的粒径为单因素进行实验，研究其对红景天苷和酪醇提取率的影响. １．７ 响应曲面的试验设计以单因素的实验结果为依据，利用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ８．０．６．１软件设计Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面实验，选取乙醇质量分数、提取时间、液固比３个主要影响因素为自变量，以红景天苷和酪醇的提取率为响应值，如表１. 表1 响应曲面设计的因素Table1 Factors of response surface experiments２ 结果与讨论２．１ 溶剂的选择不同的溶剂由于其极性及相似相容的原理对红景天苷和酪醇的溶解能力不同. 在天然产物有效成分提取中，常用的有机溶剂为水、甲醇、乙醇以及它们的混合物，本实验考察了以上３种溶剂及其不同配比的混合溶剂对红景天苷和酪醇提取率的影响，从而优选出一种合适红景天苷和酪醇的提取剂. ２．１．１ 甲醇质量分数对红景天苷和酪醇提取率的影响 称０．５ ｇ处理过的干燥红景天粉末，固定提取条件为：微波提取时间１０ ｍｉｎ，微波功率６００ Ｗ，提取温度６０ ℃，液固比４０∶１，控制甲醇质量分数为２０％、４０％、６０％、８０％、１００％，考查甲醇质量分数对红景天苷和酪醇提取率的影响. 结果见图２（a）. 由图２（a）可知甲醇质量分数在２０％～１００％范围内，红景天苷和酪醇的提取率随着甲醇的质量分数增加先升高后减小，当甲醇质量分数为８０％时红景天苷的提取率最高，而酪醇的提取率没有明显的变化. 这可能是因为从结构上看，酪醇为红景天苷的降解产物，酪醇的极性大于红景天苷，所以更易溶于极性溶剂，因此甲醇质量分数对酪醇提取率的影响不明显. ２．１．２ 乙醇浓度对红景天苷和酪醇提取率的影响 控制微波提取条件与２．１．１相同，控制乙醇质量分数为１０％～９０％，考查乙醇质量分数对红景天苷和酪醇提取率的影响. 结果见图２（b）. 图２ （a）甲醇溶度对红景天苷和酪醇提取率的影响； （b）乙醇溶度对红景天苷和酪醇提取率的影响Ｆｉｇ．２ （a）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ； （b）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ由图２（b）可知随着乙醇质量分数在１０％～９０％的范围内，红景天苷提取率的变化幅度明显大于甲醇溶液对红景天提取率的影响，这是因为３种溶剂水、甲醇、乙醇的极性依次减小，因此随着乙醇浓度的变化，乙醇水溶液的极性变化要比甲醇溶液大，而红景天苷相对酪醇属于弱极性物质，因此它的提取率受提取溶剂极性的影响要大，从图２（b）可以看出，当乙醇质量分数为３０％红景天苷的提取率达到最高，而酪醇的提取率没有明显的变化. ２．２．３ 不同ｐＨ值的溶液对红景天苷和酪醇提取率的影响 红景天苷和酪醇均含有酚羟基，具有失去质子的能力，因此提取溶剂的ｐＨ值也是提取过程中需要考察的对象. 控制微波提取条件与２．１．１相同，分别以乙醇水溶液和水溶液为提取剂，考察了不同的表观ｐＨ值的提取溶剂对红景天苷和酪醇提取率的影响. 结果见图３. 图３ （a）不同ｐＨ值的乙醇溶液对红景天苷和酪醇 提取率的影响；（b）不同ｐＨ值的水溶液对红景天苷和酪醇提取率的影响Ｆｉｇ．３ （a）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ； （b）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅｏｆ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ图３（a）为不同ｐＨ值的质量分数３０％乙醇溶液对红景天苷和酪醇的提取率的影响，结果表明不同表观ｐＨ值的乙醇溶液对红景天苷和酪醇的提取率影响不大. 图３（b）为不同ｐＨ值的水溶液对红景天苷和酪醇的提取率的影响. 结果表明，在不同ｐＨ值水溶液中，ｐＨ值的变化对酪醇的提取率也无明显影响，但对红景天苷提取率的影响较大，当在ｐＨ＝８的弱碱性条件下红景天苷提取率稍有增加. 红景天苷受ｐＨ影响更大一些是因为从结构上看，它含有的羟基更多，更容易与水发生相互作用，因此在水溶液中ｐＨ的影响对红景天苷更明显，而在乙醇中ｐＨ的影响对红景天苷与酪醇都不明显. ２．２．４ 不同提取溶剂对红景天苷提取率影响的比较 控制微波提取条件与２．１．１相同，分别比较了质量分数８０％的甲醇溶液，质量分数３０％的乙醇溶液，ｐＨ值为８的质量分数３０％乙醇溶液，纯水和ｐＨ值为８的水溶液对红景天苷含量的影响. 结果见图４. 图４ 不同溶剂的影响Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎs 由图４可知，当提取剂为质量分数８０％的甲醇溶液时红景天苷的提取率最高，提取剂为质量分数３０％乙醇溶液和ｐＨ值为８的质量分数３０％乙醇溶液时红景天苷的提取率其次，提取剂为纯水和ｐＨ值为８的水溶液时红景天苷的提取率最低. 由于以质量分数３０％乙醇为提取剂时红景天的提取率仅比溶液质量分数８０％甲醇的提取率低６．４９０％，而且ｐＨ值对红景天苷和酪醇提取率的影响也不大，因此综合考虑，用水提取杂质较多，而甲醇的毒性较大，最终选择质量分数３０％的乙醇溶液做提取剂. ２．２ 不同原料粒径对红景天苷和酪醇提取率的影响原料的粒径大小会影响提取过程中目标提取物的固液传质，另外，不同粒径的药材其组织结构可能也会不同，因此需要对原料的粒径进行考察. 本文控制微波提取条件与２．１．１相同，分别考查原料粒径为８３０、２５０、１５０ μｍ对红景天苷和酪醇含量的影响. 结果见图５（ａ）. 图５ （a）不同原料粒径对红景天苷和酪醇提取率的影响； （b）不同温度对红景天苷和酪醇提取率的影响Ｆｉｇ．５ （a）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ； （b）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ由图５（a）可知，随着原料粒径的增加红景天苷的含量先增加后减少，当原料粒径为２５０ μｍ时，红景天苷的含量最高. ２．３ 不同提取温度对红景天苷和酪醇提取率的影响一般情况下，随着温度升高物质的传质效率会提高，但过高的温度对天然活性成分的稳定性又是不利的，因此，需要对提取温度的影响进行考察. 控制液固比、微波提取时间、功率与２．１．１相同，以质量分数３０％的乙醇溶液为提取剂，控制温度分别为３０、４０、５０、６０、７０ 、８０ ℃考查不同温度对红景天苷和酪醇含量的影响. 结果见图５（b）. 由图５（b）可知，随着温度的增加红景天苷的提取率先增加后减少最后趋于平缓，当温度为６０ ℃红景天苷的提取率最高，而酪醇含量随着温度的升高先增加再趋于平缓最后减少. 这可能是高温红景天苷和酪醇分解，使得二者的含量减少. ２．４ 不同提取时间对红景天苷和酪醇提取率的影响控制固液比、提取温度、微波功率与２．１．１相同，考查不同时间对红景天苷和酪醇提取率的影响. 结果见图６（a）. 图６ （ａ）不同提取时间比对红景天苷和酪醇提取率的影响；（ｂ）不同液固比对红景天苷和酪醇提取率的影响Ｆｉｇ．６ （ａ）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ； （ｂ） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｔｙｒｏｓｏｌ由图６（a）可知，随着提取时间的增加，红景天苷的提取率逐渐增加最后趋于平衡，而酪醇的提取率随时间的增加没有明显的变化. 这可能是酪醇的溶解度大、扩散速度快，在很短的时间内就能提取出来，时间对酪醇的提取没有很大的影响. ２．５ 不同固液比对红景天苷和酪醇提取率的影响控制液固比、提取时间、提取温度、微波功率与２．１．１相同，称取０．５ ｇ处理过的干燥红景天粉末，固定提取条件为：微波提取温度６０ ℃，微波功率６００ Ｗ，提取时间１５ ｍｉｎ，提取剂为质量分数６０％的乙醇溶液，控制固液比为１０∶１、２０∶１、３０∶１、４０∶１、５０∶１考查不同的液固比对红景天苷和酪醇提取率的影响. 结果见图６（b）. 由图６（b）可知，红景天苷的提取率随着液固比的增加先增加后减小，而酪醇的提取率随着液固比的增加而逐渐减小. 可能是液固比的增加，增加了红景天含和溶剂间的浓度差，使得传质速度加快，但是继续增加液固比则其他杂质也随着溶解出来影响了红景天苷和酪醇的溶出. ２．６ 响应曲面实验结果与分析根据实验结果，把所得到的实验数据进行回归拟合，分别得到二者的二元多次回归方程为：Ｒ１＝０．８６３ ５－０．０１４ ７１Ａ＋７．９４９×１０－４Ｂ－０．０１５ ０４Ｃ－９．９９９×１０－５ＡＢ＋１．１９６×１０－４ＡＣ－２．０９０×１０－５ＢＣ＋１．５２５×１０－４Ａ２＋１．００４×１０－４Ｂ２＋２．４６２×１０－４Ｃ２；Ｒ２＝０．０２１ ８５－３．１７２×１０－４Ａ＋９．３０７×１０－５Ｂ－４．０９８×１０－４Ｃ－２．９０９×１０－６ＡＢ＋５．２１２×１０－７ＡＣ－１．９９７×１０－６ＢＣ＋３．９４８×１０－６Ａ２＋１．６７０×１０－６Ｂ２＋９．５９４×１０－６Ｃ２，式中Ｒ１、Ｒ２分别为红景天苷和酪醇提取率的预测值，Ａ、Ｂ、Ｃ分别为乙醇浓度、提取时间以及液固比的编码值，见表2.表2 响应曲面的设计及结果Table 2 Design and extraction results of response surface对红景天苷的回归模型进行显著性分析，结果见表３. 由表３的结果可以看出，该模型的ｐ值为０．０００ １小于０．０１，是极显著的，而失拟项的ｐ值为０．７０９ ９大于０．０５，是不显著的［８］. 表3 红景天苷模型的方差分析Table 3 Variance analysis of salidroside model对酪醇的回归模型进行显著性分析，结果见表４. 由表４的结果可以看出，该模型的ｐ值为０．０１３ ３０小于０．０５，是显著的，而失拟项的ｐ值为０．６７４ ６大于０．０５，是不显著的. 由表３可以得到，红景天苷模型的校正确定系数Ｒ２为０．９７１ ３，并且修正相关系数Ｒ２Ａｄｊ为０．９３４ ３，响应变异系数ＣＶ值为３．１３０，说明该模型的拟合程度好，能够较好的预测红景天苷的提取工艺，得到的数据真实可信. 该模型的方程的一次项Ａ和二次项Ａ２达到了极显著水平，交互项ＡＢ 和二次项Ｃ２达到了显著的水平，说明红景天苷的提取率与提取工艺之间是非线性的关系. 同理对酪醇的模型进行分析，可以得出相同的结论. 由于不同的等高线形状反应出两因素之间的交互作用不同，圆形等高线表明两个试验因素之间的交互作用不显著，而马鞍形和椭圆形等高线则相反［９］. 为了进一步研究本实验所选取的各个变量之间的交互作用，下文将利用响应曲面线图和等高线图来进行分析. 表4 酪醇模型的方差分析Table 4 Variance analysis of tyrosol model ２．６．１ 响应曲面分析 图７、图８分别显示了不同交叉因素对红景天苷和酪醇提取率的交互影响. 图７ 对红景天苷提取率影响的响应面和等高线图Ｆｉｇ．７ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ图８ 各因素对酪醇提取率影响的响应面和等高线图Ｆｉｇ． ８ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌｏｔｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｏｌ图７（ａ）、７（ｂ）为乙醇质量分数和提取时间的交互作用对红景天苷提取率影响，从图中可以看出乙醇质量分数和提取时间交互作用显著，沿乙醇质量分数轴方向的等高线密集，沿提取时间轴方向等高线稀疏，说明乙醇质量分数对红景天苷的提取率影响比提取时间显著，与表３的数据一致. 低浓度乙醇有利于红景天苷的提取，在等高线图中显示为曲线较陡. 图７（ｃ）、７（ｄ）为乙醇质量分数和液固比的交互作用对红景天苷提取率影响，从图中可以看出对于红景天苷提取率乙醇质量分数和液固比交互作用是显著的，沿乙醇质量分数轴方向的等高线密度比沿液固比轴方向变化大，说明乙醇质量分数对红景天苷的提取率影响大于液固比，与表３的数据相符. 并且低质量分数的乙醇对红景天苷的提取是有利的，是因为该区域曲线较陡；而在低乙醇质量分数区，液固比的曲线比较陡峭，低的液固比有利红景天苷的提取. 图７（ｅ）、７（ｆ）为提取时间和液固比的交互作用对红景天苷提取率影响，从图中可以看出提取时间和液固比交互作用不显著，沿提取时间轴方向和液固比轴方向等高线密度变化不大，是一组同心圆，说明二者对红景天苷的提取率影响都不大. 图８（ａ）、８（ｂ）为乙醇质量分数和提取时间的交互作用对酪醇提取率影响. 从图中可以看出提取时间和乙醇质量分数交互作用是显著的，沿乙醇质量分数轴方向的等高线密集，沿时间轴方向等高线稀疏，说明乙醇质量分数对酪醇的提取率影响比提取时间显著，与表４的数据一致. 低质量分数乙醇有利于酪醇的提取，在等高线图中显示为曲线较陡. 图８（ｃ）、８（ｄ）为乙醇质量分数和液固比的交互作用对酪醇提取率影响. 从图中可以看出对于酪醇提取率乙醇质量分数和液固比交互作用是不显著的，但是沿乙醇质量分数轴方向的等高线密度比液固比轴方向变化大，说明乙醇质量分数对酪醇提取率影响大于液固比，与表４数据相符. 低质量分数乙醇有利于酪醇的提取，在等高线图中显示为曲线较陡. 图８（ｅ）、８（ｆ）为提取时间和液固比的交互作用对酪醇提取率影响. 从图中可知沿液固比轴方向的等高线变化略大于沿提取时间轴方向，而在长时间区，液固比曲线更为陡峭，因此长的提取时间有利于酪醇的提取. 对所得到的回归方程进行一阶求偏导，令其等于零，分别得到Ａ＝２０，Ｂ＝３５，Ｃ＝１０，转换后红景天苷和酪醇最佳提取条件为乙醇质量分数为２０％，提取时间３５ ｍｉｎ，液固比为１０，在此条件下提取的红景天苷和酪醇的理论值分别为０．６０１ ７％，０．１６６ ０％. ２．６．２ 验证实验 为验证该最佳提取工艺的可靠性，采用上述得到的响应面优化结果进行红景天苷和酪醇的提取的验证，设定提取温度６０ ℃，微波功率６００ Ｗ. 得到红景天苷和酪醇的提取率分别为０．５９７ ２％，０．１５８ ０％，与理论值相差较小，因此利用响应曲面法优化红景天苷和酪醇的提取工艺是有效可行的. ３ 结 语本实验在单因素实验的基础上，通过响应曲面优化提取工艺，建立了二次多项数学模型. 该方法能够给出图形，比较直观的得出各试验因素的显著性及相互作用，能够直接得结果，而传统的正交实验设计则受到了限制［１０－１２］. 经过优化红景天苷和酪醇的最优提取条件为：提取温度６０ ℃、微波功率６００ Ｗ、提取时间３５ ｍｉｎ、乙醇质量分数２０％、液固比１０∶１，在此条件下做三次平行试验，红景天苷和酪醇的提取率为０．５９７ ２％、０．１５８ ０％，与理论值最大提取率０．６０１ ７％，０．１６６ ０％接近. 说明将响应曲面法运用到红景天苷和酪醇的提取工艺中能够减少操作工艺的盲目性，进一步为实验提供理论依据.致 谢感谢国家自然科学基金委对本研究的支持.