《武汉工程大学学报》  2015年03期 15-19   出版日期：2015-04-23   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ
红花中羟基红花黄色素Ａ的提取工艺


０　引　言红花（Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｃａｒｔｈａｍｕｓ）为菊科植物的干燥管状花. 具有活血通经，祛瘀止痛之功效，其药花性湿、味辛微苦. 红花中含有红色素和黄色素两种色素［１］，其中羟基红花黄色素Ａ（ＨＳＹＡ）为红花黄色素中药效最好，而且含量最多的一种查尔酮苷类化合物，是红花中最有效的水溶性成分［２］. 研究表明，ＨＳＹＡ结构如图１，可有效抑制血小板激活因子的诱发血小板聚集和释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合［３－８］，此外还用于保健品和化妆品中［９］. 本实验利用正交设计，采用Ｌ９（３４）正交表以ＨＳＹＡ的含量为标准进行实验，探讨了ＨＳＹＡ的最佳提取条件，为红花制剂的质量控制标准提供了科学依据. 图１　羟基红花黄色素Ａ的结构Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙ ｓａｆｆｌｏｗｅｒ ｙｅｌｌｏｗ Ａ１　实验部分１．１　仪器与试剂ＫＱ５２００Ｂ超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ＪＹ５００２电子天平（南京远拓科学仪器有限公司），ＤＨＧ－９１４３Ｂ５－Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械有限公司），ＤＩＯＮＥＸ，Ｐ６８０ ＨＰＬＣ Ｐｕｍｐ高效液相色谱仪（戴安公司），ＺＦ－２０Ｄ紫外可见分光光度计（巩义予华仪器有限责任公司）.所用药材红花样品由湖北襄阳隆中药业基团有限公司提供，经隆中药业肖作武总工鉴定，并保存于武汉工程大学化工与制药学院制药工程部实验楼７０６室. 实验所用水为蒸馏水，高效液相所用试剂为色谱级，其它均为分析级. １．２　质谱条件 鞘气：４５ ｕｎｉｔ／ｍｉｎ，喷雾电压：４．５ ｋＶ，加热毛细管温度：３００ ℃，扫描方式：正离子扫描和负离子扫描，扫描质量范围：５０~２ ０００. ＬＣ－ＭＳ分析结果：ＨＳＹＡ的液相色谱条件（面积归一法）：甲醇：质量分数１．０％乙酸缓冲液＝３∶７，流速：１．０ ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长：３２０ ｎｍ，柱温：２０ ℃，保留时间：ｔ＝５．６４ ｍｉｎ. １．３　红花水提液的制备 精确称量红花药材５ ｇ，按料液比１００ ｍＬ·ｇ－１加入蒸馏水，置于超声容器中６０ ｍｉｎ，静置１２ ｈ，过滤浓缩定容至５０ ｍＬ，取２ ｍＬ再稀释至５０ ｍＬ作为分析用样品. １．４　方法学考察１．４．１　精密度试验　 取步骤１．３中供试液按１．２的色谱条件连续进样６次，测得ｔ＝５．６４ ｍｉｎ对应峰相对保留时间的ＲＳＤ≤０．４１％，相对峰面积ＲＳＤ≤４．６％，可见仪器精密度良好. １．４．２　重复性试验　 精密称取５ ｇ样品６份，按１．３的方法制得供试液，按１．２的色谱条件进样测得ｔ＝５．６４ ｍｉｎ对应峰相对保留时间的ＲＳＤ≤０．３５％，相对峰面积ＲＳＤ≤３．４％，可见该方法重现性良好. １．４．３　稳定性试验 取１．３供试液，分别在０、２、４、８、１２、１６ ｈ按１．２的色谱条件进样，可测得ｔ＝５．６４ ｍｉｎ对应峰相对保留时间ＲＳＤ≤０．４６％，相对峰面积ＲＳＤ≤１．９％，说明样品在１６ ｈ内稳定. ２　结果与讨论２．１　单因素实验２．１．１　乙醇质量浓度的影响 固定提取次数为一次，准确称量２ ｇ红花药材５等份，分别加入１０倍（ｖ／ｖ）量的水，质量分数１０％、４０％、７０％、９５％乙醇，室温条件下浸提６０ ｍｉｎ，抽滤、浓缩后加水定容至１００ ｍＬ，不同浓度乙醇提取后ＨＳＹＡ的含量分析结果见图２. 图２　不同乙醇质量分数对ＨＳＹＡ质量分数的影响Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＨＳＹＡ由图２可知，当乙醇质量分数达到７０％，ＨＳＹＡ的提取已趋平衡. 这个结果与ＨＳＹＡ的结构是相关的：ＨＳＹＡ是一个含有两个单糖的双糖查尔酮苷，结构中的１２个羟基使该物质有一定的亲水性，所以在查尔酮母核和糖的共同作用之下，ＨＳＹＡ既有一定的亲水性，也有一定的亲脂性，实验表明，当乙醇质量分数为７０％时，对ＨＳＹＡ的溶解度达到最高.２．１．２　提取温度的影响　 准确称量２ ｇ红花药材５等份，加入１０倍（ｖ／ｖ）量的质量分数７０％乙醇，提取时间为６０ ｍｉｎ，提取的温度分别为２０、３０、４０、５０、６０ ℃，抽滤、浓缩后加水定容至１００ ｍＬ. 不同温度提取时ＨＳＹＡ的质量分数分析结果见图 ３.图３　不同提取温度对ＨＳＹＡ质量分数的影响Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＨＳＹＡ由图３得，根据溶解原理，温度高溶解度会增大，所以当提取温度从２０ ℃升至５０ ℃时，ＨＳＹＡ的质量分数是越来越高，当温度在５０ ℃时达到最高. 但是如果继续提高提取温度到６０ ℃，发现其质量分数反而降低，这是因为ＨＳＹＡ结构中含有酚羟基、双键和苷键等易于氧化、水合和水解的官能团，温度持续的升高加大了ＨＳＹＡ形成醌、次生苷以及苷元的可能，使其含量急剧下降. 通过此单因素实验确定其最佳提取温度是５０ ℃. ２．１．３　溶剂用量的影响 准确称量２ ｇ红花药材５等份，分别加入５、１０、１５、２０、２５倍（ｖ／ｖ）量的质量分数为７０％乙醇，５０ ℃下浸提６０ ｍｉｎ，抽滤、浓缩后加水定容至１００ ｍＬ，不同溶剂用量提取后ＨＳＹＡ的质量分数分析结果见图４. 图４　不同溶剂用量对ＨＳＹＡ质量分数的影响 Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｎｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＨＳＹＡ由图４可得，随着溶剂用量的增加，ＨＳＹＡ的质量分数相应增大，说明增大溶剂用量有利于ＨＳＹＡ的充分提取. 但是当红花药材和溶剂体积比到１５、２０和２５倍时，ＨＳＹＡ的质量分数基本成了一条直线，继续增加溶剂的用量，ＨＳＹＡ质量分数并没有增加，说明体积比为１５时提取已趋于完全，更多的提取溶剂只会增加后处理中蒸发溶剂的成本. ２．１．４　超声提取时间的影响 　准确称量２ ｇ红花药材５等份，加入１５倍（ｖ／ｖ）量的质量分数为７０％乙醇，室温条件下分别超声提取０、５、１０、１５、２０ ｍｉｎ，再依次静置浸提６０、５５、５０、４５、４０ ｍｉｎ，抽滤、浓缩后加水定容至１００ ｍＬ. 不同超声时间提取后，分析ＨＳＹＡ的质量分数，结果见图５. 由图５可得，超声提取１５ ｍｉｎ，ＨＳＹＡ质量分数达到最高，延长超声时间ＨＳＹＡ含量下降，超声虽能在空化效应的作用下使得植物细胞壁及整个生物体破裂，有利于有效成分的溶出，但长时间的空化效应不仅会使植物破裂，也会引入更多的杂质同时也使温度升高，而高温高压都有可能加速查尔酮苷的水解最终使得ＨＳＹＡ的质量分数下降. 图５　不同超声时间对ＨＳＹＡ质量分数的影响Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ｏｎｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＨＳＹＡ表1　L9 (34)正交试验的因素和水平Table 1　The factor and levels of orthogonal design表2　正交试验设计和结果Table 2　The orthogonal design and results通过以上单因素实验发现用１５倍的质量分数为７０％乙醇在５０ ℃超声提取１５ ｍｉｎ， ＨＳＹＡ的质量分数达到最高.２．２　正交实验通过上述单因素实验结果，可以确定固定提取次数为一次的情况下，乙醇质量分数、溶剂用量、提取温度及超声时间对ＨＳＹＡ的提取有显著影响. 选择乙醇质量分数（Ａ）、溶剂量（Ｂ）、提取温度（Ｃ）、超声时间（Ｄ）四个因素考察，每因素各取３个水平，结合红花药材处理及对ＨＳＹＡ纯化尝试的实验经验，安排Ｌ９（３４）正交试验表１.３　结　语首先本实验采用单因素实验法，找出提取的最佳单因素点分别是：质量分数为７０％的乙醇为最佳比例；５０ ℃为提取最佳温度；溶剂用量体积比为１５时最佳；１５ ｍｉｎ为超声最适时间. 然后以乙醇质量分数、溶剂用量、提取温度、超声时间为因素设计正交实验，分析正交试验结果可知，超声提取对ＨＳＹＡ的提取影响最为显著，影响因素的主次顺序为超声时间﹥乙醇质量分数﹥提取温度﹥溶剂用量. 以高效液相检测ＨＳＹＡ的质量分数为指标，超声时间对ＨＳＹＡ的提取有显著影响，超声时间控制在一定范围内，可充分提取ＨＳＹＡ；乙醇质量分数对ＨＳＹＡ的影响次之，保持一定质量分数的乙醇，可以使ＨＳＹＡ完全溶解，保持ＨＳＹＡ的提取质量分数较高；严格控制温度，不仅可以提高ＨＳＹＡ的质量分数，还可以降低ＨＳＹＡ因受热水解变性的可能性；溶剂量的影响较小，在保证红花药材充分浸泡的前提下，可以适当减少溶剂用量，这样不仅降低了后处理的工作负荷，还降低了成本. 本实验最终确定ＨＳＹＡ的最佳提取工艺为Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ３，即５０ ℃下，加入１０倍量的质量分数７０％乙醇超声提取２０ ｍｉｎ效果最佳. 致　谢感谢武汉工程大学化工与制药学院提供的试验平台，感谢本实验室其他成员的帮助！