《武汉工程大学学报》 2013年02期
37-41
出版日期：2013-02-28
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测
0引言免疫学技术正沿着基础研究－应用研究－高技术开发研究3条主线在开展，三者互相促进，推动现代医学的发展\[1\].杂交瘤技术的建立和细胞因子对免疫细胞发育、分化的发现，基因工程技术的发展，使实验室的研究直接转向生物高技术产品的开发，如重组细胞因子、单克隆抗体及其相应的试剂盒、多克隆抗体、基因工程抗体和疫苗等已经或正在投入临床使用，特别是抗体药物以其对人体无毒无副作用、完全天然和高度特异性的疗效，越来越显示其优势，并创造出巨大的社会效益和经济效益\[2\].1962年，Ashford等\[3\]报道在电子显微镜下发现肝细胞自噬现象，近年来由于发现与自噬相关的基因，以及自噬在生物体生理和病理等方面的作用，自噬基因融合蛋白（ATG12）是与自噬相关基因表达的蛋白.本研究合成带谷胱甘肽转移酶（GST）标签ATG12融合蛋白来免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体、酶联免疫吸附法（ELISA）检测抗体效价、蛋白印迹（Western blotting）检测抗体特异性及在组织中的表达情况、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）检测其浓度. 1实验部分1.1材料1.1.1研究对象新西兰大白兔.1.1.2实验试剂抗原；乙醇；20 mmol/L 磷酸缓冲溶液pH 7.2；福氏佐剂；GST透析液；His溶液；PBS溶液；couping buffer；pH 5.0的甘氨酸；pH 2.0的HCl溶液；1 mol/L Tris封闭液；pH 5.0 HCl溶液；CBB溶液；0.01 mol/L Tris pH 7.5中和液；甘油；防腐剂NaN3；HRP酶标二抗；质量分数2% SKL；beads；0.01 mol/L PBS (pH 7.3)；10％ 分离胶；质量分数4％ 浓缩胶；G250考马斯亮蓝溶液；0.15 mol/L NaCl 溶液；2×（5×）SDS上样缓冲液；甲醇；电泳缓冲液；转移缓冲液；10×丽春红染液、封闭液；TBST；TBS；ECL显影底物；显影液；定影液；DAB溶液；化学发光试剂、HRP酶标二抗；脱脂奶粉；1 mol/L 的NaHCO3；TMB显色液；所有试剂均为分析级.1.2实验方法1.2.1抗血清的制备具体方法如下\[4\]：a.新西兰大白兔的免疫.免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1 mL左右.抗原剂量，首次剂量为300~500 μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右.每2~3周加强免疫一次.加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5 mL，加强免疫时不必注射百日咳疫苗.在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2~3 mL血，制备血清，检测抗体效价.b.抗血清的采集与保存.取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血.取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身.剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30 s后，耳血管扩张、充血.用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30~40 mL.然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯.二星期后，可在另一耳放血.此法可反复多次放血.颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血.取收集的血液在37 ℃恒温箱中放置30 min以防止激活补体系统，再将试管在4 ℃放置过夜使血液凝固.用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，于4 ℃下4 000 r/min离心10 min.在无菌条件，吸出血清，分装，可在-20 ℃保存数年.1.2.2抗体的纯化具体步骤如下\[5\]：a.抗原柱子的制备.找到相应的血清和抗原、抗原的透析（对非包涵体蛋白）、活化beads、抗原与beads连接、封闭beads.b.抗血清的预处理.将解冻好的血清在3 600 r/min，条件下离心17 min；除去离心后浮在表面的脂肪，将血清转移到标记好的瓶子中备用，注意尽量不要将沉在管底的血细胞倒出；对免疫原是GST融合蛋白的血清，同时是纯化抗原也是GST融合蛋白，此时需过GST柱子，吸附掉antiGST的抗体.注意此时要留抗原小样，做ELISA检测看antiGST的抗体有没有除尽.第2期朱雄伟，等：自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测武汉工程大学学报第35卷c.beads与对应的抗血清的结合.将连接好抗原的beads和对应的抗血清一起孵育，封口后排气，在转子上固定好，孵育，室温2 h或4 ℃过夜，让血清流出纯化管，收集，10 mL PBS洗涤三次.d.收集抗体.加入10 mL pH5.0甘氨酸，预洗脱，加入预冷的HCl洗脱液.同时检测收集的抗体浓度，确定收集峰，收集浓度高抗体，于4 ℃暂时保存.e.浓缩和透析.将浓度不高的抗体吸水浓缩，注意放4 ℃保持低温.浓缩好后透析.次日检测收集的抗体浓度，确定收集峰.收集浓度高抗体，于4 ℃暂时保存.f.beads的清洗和保存.依次用Tris和PBS洗，加入甘油、防腐剂-20 ℃保存.1.2.3 ELISA检测\[68\]a.抗原包被.用抗原包被液（1 mol/L的NaHCO3）稀释抗原，50 微升/孔，蛋白量为2~3 μg/mL，孵育，室温2 h或4 ℃过夜，用GST标签蛋白作对照.b.封闭.倒出孔内溶液，拍干，每孔加入100 uL稀释液 (3% 脱脂牛奶+PBST)，封闭，放摇床上室温孵育1 h.c.加一抗.倒出孔内溶液, 拍干，洗3次，每次5 min.倒出孔内溶液, 拍干，加入一抗，摇床上室温孵育1 h.d.加二抗.倒出孔内溶液, 拍干，洗三次，每次5 min.倒出孔内溶液, 拍干，加入二抗，摇床上室温孵育1 h.e.加底物显色.TMB显色液A、B按1∶1混合，100 μL/孔，放摇床上15 min内观察结果，照相.f.SDSPAGE电泳.电泳时间一般4~5 h，电压为40 V较好，也可用60 V.电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜.g.转膜.（1）转一张膜需准备6张7.0~8.3 cm的滤纸和1张7.3~8.6 cm的PVDF膜，将切好的PVDF膜置于甲醇上浸才可使用.（2） 在加有转移液的塑料盒里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜.（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平.在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡.（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬.撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻璃板.小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡.在膜上盖3张滤纸并除去气泡.最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子.整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡，膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路.（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温.一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h.（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5 min，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白.将膜晾干备用.h.免疫反应.（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h.（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度，撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，室温下孵育1~2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，再用TBS洗一次.（3）准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1~2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBST洗一次，10 min，进行化学发光反应.i.化学发光、显影、定影\[910\].（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合，1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入暗盒中.（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出胶片，用切纸刀剪裁适当大小；打开暗盒，把胶片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上暗盒，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开暗盒，取出胶片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影.显影时间一般为1~2 min（20~25 ℃），显影结束后，马上把胶片浸入定影液中，定影时间一般为5~10 min，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干. 2结果与讨论2.1GST柱子分析免疫原是GST融合蛋白的血清，同时是纯化GST柱子的穿流夜FtGST融合蛋白，此时需过GST柱子，用来吸附掉antiGST的抗体.图1所示的是未过GST柱子的血清F和GST柱子的穿流液Ft加入TMB底物后显色反应，表1所示的是血清F与穿流液Ft的稀释梯度\[1112\].表1血清F与穿流液Ft的稀释梯度Table 1Dilution gradient of serum F and transit fluid Ft血清F穿流夜Ft1∶5001∶5001∶1 0001∶1 0001∶2 0001∶2 0001∶4 0001∶4 000图1血清F（“1”）与穿流液Ft（“2”）的显色反应Fig.1Chromogenic reaction of serum F and transit fluid由图1和表1可知：在四种梯度下，血清F加TMB底物显色后四孔全部显蓝色，而穿流液Ft全部无色，说明antiGST已除干净. 2.2ELISA结果分析图2所示的是未过GST柱子的血清F、GST柱子的穿流液Ft和抗体Pu加入TMB底物后显色反应、表2所示的是血清F、穿流液Ft和抗体Pu的稀释梯度.图2血清F、穿流液Ft、抗体Pu的显色反应Fig.2Chromogenic reaction of serum F, transit fluid Ft and antibody Pu由图2和表2可知,以Ft为参照，F、Ft、Pu显色孔数依次为4，3，4，其中Ft的是底色.结果说明血清还可以进一步纯化，而且收集的纯化血清效果也不错，即稀释度为1：500 000.表2血清F、穿流液Ft、抗体Pu的稀释梯度Table 2Dilution gradient of serum F , transit fluid Ft and antibody Pu血清F穿流液Ft抗体Pu1∶5001∶5001∶5001∶5 0001∶5 0001∶5 0001∶50 0001∶50 0001∶50 0001∶500 0001∶500 0001∶500 0002.3SDSPAGE测定ATG12多克隆抗体浓度\[13\]使用SDSPAGE测定蛋白质浓度，图3所示的是ATG12多克隆抗体的SDSPAGE图.如图3所示：左边的条带为ATG12蛋白，右边为marker条带，marker的分子质量图中已经标出.以67 kD为参照来估测蛋白浓度，67 kD代表的marker质量浓度为每10 μL含8 μg，而目的蛋白的颜色只有其5/8深，则蛋白浓度为每10 μL 5/8×8 μg,即每10 μL为5 μg.图3ATG12多克隆抗体的SDSPAGEFig.3SDSPAGE of ATG12 polyclonal antibody图4免疫印记蛋白质大小Fig.4Size of Immune mark protein2.4Western blotting分析图4所示的是免疫印记蛋白质大小及在Colon（结肠）中的表达条带中的表达情况.由图4可知：Western blotting条带上的点清晰，说明其能在结肠中较好的表达，由图知蛋白质大小为55 kD左右.3结语使用带GST标签的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备得到ATG12多克隆抗体，运用ELISA及Western blotting检测结果显示此抗体效价及特异性较高，Western blotting检测结果显示其在结肠组织中表达，SDSPAGE结果显示其浓度也较高.本研究成功得到浓度较高的ATG12多克隆抗体，并证实其在结肠组织中表达较明显.致谢感谢天惠生物公司对本研究的支持与帮助.