《武汉工程大学学报》 2012年12期
4-7
出版日期：2013-01-11
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
壳寡糖对烟草赤星病病原菌的抑制作用
0引言烟草黑胫病、赤星病等真菌病害严重影响了烟草的产量和质量，采用化学农药控制烟草病害仍然很普遍.然而，化学农药的残留对生物和环境存在着潜在的威胁，而且它们的使用导致病原菌的抗性问题越来越严重.为此，开发化学农药替代品的研究日益引起人们的重视\[1\].壳寡糖是由2~10个2氨基葡萄糖通过β1,4糖苷键连接而成的一种寡糖\[2\].壳寡糖为壳聚糖的衍生物，壳聚糖及其衍生物属含氮高分子聚合物，在土壤中易被微生物分解，其终产物可被植物吸收\[3\].利用壳寡糖控制病原真菌的研究已有大量报道\[1-7\].应用壳寡糖抑制烟草真菌病原菌的报道较少.本研究旨在探索壳寡糖对烟草赤星病病原菌的抑制效果.通过测定不同浓度的壳寡糖对烟草赤星病病原菌的菌丝生长、孢子萌发、产孢的抑制作用及壳寡糖抑菌作用的热稳定性和pH值对壳寡糖抑菌作用的影响.1实验部分1.1材料
1.1.1壳寡糖壳寡糖由大连中科格莱克生物科技有限公司提供，批号MP91，聚合度为2~10，平均分子量≤1 000.
1.1.2菌种来源链格孢菌\[Alternaria alternata (Fr.) Keissler\] 由湖北省烟草科研所提供的赤星病病原菌.
1.1.3培养基马铃薯蔗糖琼脂（potato sucrose agar, PDA）培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉18 g，自然状态pH值.121 ℃下湿热灭菌20 min备用.1.2方法
1.2.1抑制菌丝生长试验称取一定量的壳寡糖粉末，用无菌水溶解后得到质量浓度为200 g/L的原液，吸取一定量的壳寡糖原液，注入到定量的PDA培养基中，使培养基中的壳寡糖质量浓度分别为10,12,15 g/L，对照组添加等量的无菌水.赤星病病原菌在PDA培养基上培养7 d后，用打孔器获得生长旺盛的菌饼（Φ7.6 mm），将菌饼接种到装有不同质量浓度壳寡糖PDA培养基的培养皿(Φ90 mm)中央，实验组与对照组各重复5个培养皿.28 ℃培养48 h后开始采用十字交叉法测量菌落直径取平均值记录，并计算菌丝生长抑制率\[2,6-7\].
菌丝生长抑制率=
对照平均菌丝生长直径-实验组平均菌丝生长直径对照组平均菌丝生长直径-菌饼直径×
100%.
1.2.2孢子萌发试验用无菌水将在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养7 d后赤星病病原菌的孢子洗脱下来并振荡摇匀，通过二倍稀释法使其在显微镜低倍镜（×40）视野中保持个数为100左右.所需的不同质量浓度壳寡糖溶液采用1.2.1中壳寡糖原液稀释获得.采用载玻片悬滴法，将孢子悬浮液10 μL滴在凹玻片上，实验组壳寡糖质量浓度分别为0.5,1,2.5,5,10 g/L.将不同浓度壳寡糖溶液取10 μL溶液滴加在孢子悬浮液中，对照组取等量的蒸馏水作同样处理.28 ℃培养5 h后观察孢子萌发情况，每组包含三个重复，并计算孢子萌发抑制率\[3\].
1.2.3产孢量试验用无菌水将在马铃薯蔗糖琼脂培养基上培养7 d后赤星病病原菌的孢子洗脱下来，通过二倍稀释法使10 μL的孢子悬液在显微镜低倍镜（×40）视野中保持个数为100左右，统计实验组与对照组每个培养皿中孢子总数，实验组壳寡糖质量浓度分别为5，10 g/L.计算产孢量的抑制率\[7\].
1.2.4壳寡糖热稳定性试验将配制好的壳寡糖原液（200 g/L）分别置于烘箱并调节温度为40，50，60，70，80 ℃中处理20 min\[2\]，然后利用不同温度处理后的壳寡糖原液按方法1.2.1制备装有壳寡糖质量浓度为15 g/L的马铃薯蔗糖琼脂培养基的培养皿，之后操作方法同1.2.1.
1.2.5壳寡糖pH值稳定性试验吸取一定量配制好的壳寡糖原液并分别添加到四组试验组当中，在培养基固化前调节四组试验组pH值分别为4,5,6,7 .相应四组对照组加入等量的无菌水，并在培养基固化前调节其pH值为4,5,6,7之后操作方法同1.2.1，实验组壳寡糖溶液质量浓度为15 g/L \[2\].第12期胡国元，等：壳寡糖对烟草赤星病病原菌的抑制作用
武汉工程大学学报第34卷
2结果与讨论2.1壳寡糖对菌丝生长的抑制作用由图1，图2可以看出，随着壳寡糖质量浓度的提高，对赤星病病原菌菌丝的抑制作用也在提高.48 h壳寡糖质量浓度10 g/L时，对赤星病原菌菌丝的抑制率达到了89.36%.当壳寡糖质量浓度达到15 g/L时，对赤星病原菌菌丝的抑制率则达到了94.74%以上.随着培养时间的延长，壳寡糖对赤星病原菌菌丝的抑制率略有下降.2.2壳寡糖对孢子萌发的抑制作用由表1可知，壳寡糖质量浓度为2.5 g/L 以上时对赤星病病原菌孢子萌发抑制率均在100%，即使质量浓度降低至0.5 g/L，其抑制率也可以达到95.36%.从壳寡糖对赤星病病原菌孢子萌发的抑制来看，所需的质量浓度远低于对菌丝生长抑制的质量浓度，其可能的原因是孢子萌发试验中孢子量少，每个孢子充分接触壳寡糖，降低了抑制萌发所需要的质量浓度.
图1不同质量浓度壳寡糖对赤星病病原菌
菌丝生长的影响
Fig.1Effects of different concentrations of oligochi
tosan on mycelial growth of Alternaria alternata 图2不同浓度壳寡糖对赤星病病原菌
菌丝生长的影响(144 h)
Fig.2Effects of different concentrations of oligochito
san on mycelial growth of Alternaria alternata in 144 h
注： 1、2、3中壳寡糖浓度分别为10 g/L、12 g/L、15 g/L.1、2、3中左为试验组，右为对照组.表1不同浓度壳寡糖对赤星病
病原菌孢子萌发的影响
Table 1Effects of different concentrations of oligochito
san on spore germination of Alternaria alternata
浓度/(g/L)1052.510.5抑制率/%10010010099.2195.362.3壳寡糖对产孢量的抑制作用如表2所示，质量浓度为5和10 g/L的壳寡糖溶液处理赤星病病原菌144 h产孢量的抑制率分别为53.1%和69.7%，低于对菌丝生长的抑制率.表2不同质量浓度壳寡糖对赤星病
病原菌产孢量的影响
Table 2Effects of different concentrations of oligochito
san on spore production of Alternaria alternata
壳寡糖质量
浓度/（g/L）孢子数
（×107个）产孢量抑
制率/%对照组25.8512.153.1107.8369.72.4壳寡糖热稳定性如图3，图4所示，在48 h，5组壳寡糖质量溶液对赤星病病原菌的抑制率分别为90.46%，89.19%，91.88%，92.39%，92.74%.在144 h，5组壳寡糖溶液对赤星病病原菌菌丝的抑制率分别为68.13%，68.05%，65.52%，69.02%，70.13%.比较各组抑制率的大小可以得出壳寡糖的抑菌作用具有良好的热稳定性.该结果与徐俊光(2007)\[2\]报道不同温度处理不同质量浓度壳寡糖质量溶液对其抑菌活性没有显著性影响的的结果一致.图3不同温度处理后的壳寡糖对赤星病
病原菌菌丝生长的影响
Fig.3Effects of different temperature of oligoc
hitosan on mycelial growth of Alternaria alternata图4不同温度处理后的壳寡糖对赤星病
病原菌菌丝生长的影响（144h）
Fig.4 Effects of different temperature of oligochito
san on mycelial growth of Alternaria alternate in 144 h
注： 1、2、3、4、5中壳寡糖处理温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃.1、2、3、4、5中左图为试验组，右图为对照组.2.5壳寡糖pH值稳定性由图5，图6可知，pH值对壳寡糖溶液对烟草赤星病病原菌的抑菌率影响较大.在48 h，培养基pH值为4, 5, 6, 7的实验组对应的抑制率分别为100%，98%，85.05%，60.26%.在120 h，培养基pH值为4, 5, 6, 7的实验组对应的抑制率分别为100%，91.24%，68.78%，46.24%.然而，徐俊光(2007)\[2\]报道pH值对壳寡糖抑菌活性的影响因菌而异.这一结果暗示着壳寡糖对不同类别的菌可能存在不同的抑菌机理，并且说明在使用壳寡糖生物农药时要注意溶液酸碱性的影响.图5不同pH值壳寡糖对烟草病原菌菌丝生长的影响
Fig.5Effects of different pH of oligochitosan
on mycelial growth of Alternaria alternata图6不同pH值壳寡糖对烟草病原菌菌丝
生长的影响(120 h)
Fig.6Effects of different pH of oligochitosan on
mycelial growth of Alternaria alternata in 120 h
注： 1、2、3、4中培养基pH值分别4、5、6、7. 1、2、3、4中左图为试验组，右图为对照组.3结语a. 壳寡糖对烟草赤星病病原菌具有较好的抑制作用.b. 质量浓度为10 g/L的壳寡糖在48 h时，对烟草赤星病病原菌菌丝的抑制率达到了89.36%.当壳寡糖质量浓度达到15 g/L时，对赤星病原菌菌丝的抑制率则达到了94.74%以上.c. 壳寡糖质量浓度为2.5 g/L 以上时对烟草赤星病病原菌孢子萌发抑制率均在100%，所需的壳寡糖质量浓度远低于对菌丝生长抑制的浓度.d. 质量浓度为5和10 g/L的壳寡糖溶液在144 h时，对烟草赤星病病原菌产孢量的抑制率分别为53.1%和69.7%，低于对菌丝生长的抑制率.e. 壳寡糖对烟草赤星病病原菌菌丝的抑制作用对于热处理具有良好的稳定性.f. 质量浓度为15 g/L的壳寡糖PDA培养基pH值为4, 5, 6, 7在48 h时，对烟草赤星病病原菌菌丝的的抑制率分别为100%，98%，85.05%，60.26%，pH值对壳寡糖溶液的抑菌率影响较大.