《武汉工程大学学报》  2012年06期 22-26   出版日期：2012-06-30   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

---

杆状病毒在气升式反应器中感染策略优化


0引言　　利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行重组蛋白、疫苗和生物杀虫剂的大规模生产越来越受到人们的重视［1］，因此需要对其生产过程进行优化.近年来,人们主要在以下几个方面进行了优化：a.细胞生长情况［2］；b.培养基［3-4］；c.溶氧；d.反应器的设计［5］；e.感染策略［6-9］，其中包括感染复数(MOI)、感染时间 (TOI)、细胞初始浓度(ICD)和培养基的替换.利用高感染复数进行重组蛋白和病毒杀虫剂的生产过程已经很清楚，在高感染复数条件下，所有细胞都“同步”感染［10］.但在实际生产中，采用低感染复数有以下优点［11］：a.可以大大减少病毒原种的用量，无需大量扩增培养，从而减少设备投资， 缩短工艺流程，降低生产中受污染的概率;b.减少了由于高复数感染引起的“传代效应”.而且据相关报道， 在高感染复数下获得的重组蛋白的产量比低感染复数下低.因此，低感染复数下杆状病毒感染昆虫细胞的研究日益受到重视.本研究将在气升式反应器中对感染策略的4个方面 (不包括培养基的替换)： MOI、TOI、ICD和DO 进行优化.研究感染策略的文献一般只考察单因素对昆虫细胞-杆状病毒表达体系的影响.本研究将采用正交实验来进行感染策略的优化，这种方法的优点是它不仅考虑了单因素对昆虫细胞杆状病毒表达体系的影响，而且考虑到了各个因素间的相互影响.这样得到的结果对实际生产有更大的参考价值.1实验部分1.1实验材料
1.1.1培养基Grace 培养基 (GBICO公司)、胎牛血清(GBICO公司)、酵母提取物及脂类复合物 (GBICO公司)、Pluronic F-68(GBICO公司).培养基组成: Grace 培养基，5%(体积分数，下同）的胎牛血清，1% 的酵母提取物，1.5% 的脂类复合物，0.1%的 Pluronic F-68.贴壁培养、摇瓶悬浮培养和气升式反应器培养的培养基相同.
1.1.2细胞、病毒及其计数棉铃虫细胞HzAM1由中国科学院武汉病毒所提供的美洲棉铃虫细胞系.将棉铃虫细胞HzAM1在含体积分数5%（正常的情况是10% ）胎牛血清的Grace 培养基于 27 ℃下恒温培养.将细胞用质量分数0.4%台盼蓝染色后用血球计数板计数,计算活细胞浓度及细胞存活率.棉铃虫病毒 ［ Helicoverp a armiger a single nucleocapsid nucleopolyhedro virus（HaSNPV ）］由中国科学院武汉病毒所的王华林教授提供,由该所构建提供的棉铃虫病毒（HaBacHZ8-eGPF-PH)带有绿色荧光蛋白（eGFP).包涵体病毒浓度利用血球计数板在高倍显微镜下计数,使用流式细胞仪测定非包涵体病毒滴度［12］.1.2仪器与设备
1.2.1常规仪器2001 型振荡愠温培养箱（常州国华电器有限公司）,荧光显微镜（Olympus BX-51）,倒立式显微镜（XDS-1B ）,流式细胞仪（BD公司） 超低温冰箱（New Brunswick Scientific）,无油空气压缩机（扬州市恒顺机械厂）,氧气瓶、氮气瓶(青岛华青集团有限公司),pH 探头、氧探头（Broadley James 公司）,其他均为实验室常规仪器.
1.2.2气升式反应器本实验室设计的气升式反应器总体积570 mL，有效体积500 mL.配备有一个溶氧探头和一个pH探头,中间有4根金属导管,它们的作用分别是通气、取样、放气和加料.通气导管从容器底部通入无菌的空气、氧气和氮气,它的作用主要有两个：通入的气体推动溶液在反应器中循环流动,使细胞悬浮生长；通过空气、氧气和氮气的比例来调节溶氧的大小.通过计算机自动控制反应器中的溶氧值和pH值.第6期张佑红，等：杆状病毒在气升式反应器中感染策略优化
武汉工程大学学报第34卷
1.3实验方法　　将生长良好的细胞接种在100 mL的摇瓶中在振荡培养箱中培养.其中接种体积为25 mL，培养温度为27 ℃，转速为80 r·min-1.每12 h取样在血细胞计数板上测定细胞浓度，待细胞浓度达到实验要求后转入气升式反应器中培养.本实验设计了正交实验，四因素为感染复数、感染时间、细胞初始浓度和溶氧值.每个因素设计了3个水平.正交实验水平见表1.
表1正交实验因素与水平
Table 1Factors and levels of orthogonal experiments
水平FactorsICD(A)/
（105 cells·mL-1）MOI(B)TOI(C)DO(D)110.01早期10%220.1中期30%331晚期50%其中ICD为细胞接种气升式反应器时的细胞浓度，而不是细胞被感染时的细胞浓度.TOI为细胞处于对数生长期的初期、中期、晚期.　　根据以上的正交表，一共进行了9组实验，细胞接种气升式反应器后，每24 h采样测定活细胞浓度及细胞存活率，接种病毒后，每6 h采样测定BV滴度和OV浓度.2结果与分析2.1数据分析 由正交实验得到的图1、2，其最大BV滴度和OV浓度见表2.表中的km和k′m值直接反映不同水平对实验结果影响的大小，R和R′值直接反映不同因素对实验结果影响的大小.从表2中可知， 图1不同细胞初始浓度下的BV病毒滴度
Fig.1Evolution of minus logarithm of TCID50 under different ICDs图2不同细胞初始浓度下的OV病毒浓度
Fig.2Evolution of amount of OVs under different ICDs表2正交实验设计及结果（BV和OV滴度）
Table 2Effects of MOI、ICD、TOI and DO on BV titer and OV titer
编号ICD(A）/
（105 cells·mL-1）MOI(B)TOI(C)DO(D)BVmax/
（105 TCID50·mL-1）OVmax/
（104 OVs·mL-1）111115.011282122212.59138313333.16124421233.981285223179.431686231225.1214073132101348321315.851469332125.12152k16.926.3315.3336.52k236.1835.9613.915.9k31717.830.867.66R29.2629.6316.9628.86k′1130130140149.3k′2147.3150.7139.3137.3k′3144132.7142132.7R′17.320.72.716.6在条件A2B2C3D1下能够获得最大的BV滴度7.943×106 TCID50·mL-1，而且从km值可知最佳条件也是A2B2C3D1.也就是说在棉铃虫细胞-杆状病毒体系中，细胞初始浓度为2×105 cells·mL-1，细胞处于对数生长期晚期，DO为10%时，MOI值为0.1进行感染，能够得到最大的BV滴度.从表2中还可知，获得最大的OV浓度为1.68×106 OVs·mL-1，从k′m中也可知最佳条件也是A2B2C3D1.因此在棉铃虫细胞-杆状病毒体系中，细胞初始浓度为2×105 cells·mL-1，细胞处于对数生长期晚期，DO为10%时，MOI值为0.1进行感染，能够得到最大的BV滴度.这说明了杆状病毒的两种不同类型（BV和OV）的产量密切相关.
2.2ICD、MOI、TOI和DO对BV和OV滴度的影响　　从表2中的km和k′m可知，在棉铃虫细胞-杆状病毒体系中，细胞初始浓度为2×105 cells·mL-1，细胞处于对数生长期晚期，DO为10%，MOI值为0.1时进行感染，能够得到最大的BV和OV滴度.表2中R和R′值可以反映因子对实验结果的大小，MOI、ICD、DO和TOI的R值大小依次为29.63>29.26>28.86>16.96，可以说明MOI对BV滴度的影响最大，ICD次之，DO次之，TOI最小.MOI、ICD、DO和TOI的R′值大小依次为20.7>17.3>16.6>2.7，同样表明MOI对OV滴度的影响最大，ICD次之，DO次之，TOI最小.对于MOI，当MOI为1.0时，相对于MOI为0.01和0.1时，大部分细胞在初期就被感染，使得很多细胞散失了繁殖能力，因此，BV和OV的产量将在二次和多次感染的时候大幅度降低.相反，当MOI为0.01时，在第一次感染时，很少量的细胞被感染，产生的子代病毒相对较小，大部分细胞会继续，形成了一个细胞生长速度与病毒扩增速度的竞争，但在这个过程中从病毒开始感染到细胞进入死亡期，BV滴度一直不高.当MOI为0.1时，病毒在二次或者三次感染后，基本所有的细胞全部被感染，这样不仅能够得到大量的病毒，还充分利用了细胞.设定的3个细胞初始浓度依次为1×105 cells·mL-1、2×105 cells·mL-1和3×105 cells·mL-1.当细胞初始浓度为1×105 cells·mL-1时，细胞浓度比较低，进入多次感染的细胞很少.而对于3×105 cells·mL-1时，进入多次感染的细胞太多，多余的细胞继续生长， 与病毒的扩增相互竞争， 不利于病毒的扩增. 因此，细胞初始浓度为2×105 cells·mL-1相对更容易收获高产量的病毒.在DO为50%和30%时，体系中的溶氧值过高对病毒的扩增有一定的抑制作用，因此DO值为10%时相对收获的病毒滴度高.在对数生长期初期接种病毒，相对于对数生长期中期和晚期接种病毒，有一个更好的细胞生长周期和病毒的感染循环，但是相对于MOI、ICD和DO对病毒滴度的影响最小.3结语　　本研究是针对低感染复数下昆虫细胞-杆状病毒表达体系在气升式反应器中的感染策略优化，对BVs和OVs产量的影响考察了4个因素：MOI、ICD、DO和TOI.采用正交实验来选择最佳感染条件，结果表明MOI对BVs和OVs产量影响最大，ICD次之，DO次之，TOI对BVs和OVs影响最小；最佳感染条件为：MOI为0.1，ICD为2×105 cells·mL-1，DO为10%，TOI为细胞生长对数期晚期，得到了较高的BV滴度为7.943×106 TCID50·mL-1.但是本研究并没有在更低的DO环境下优化，而在低感染复数下细胞处于对数生长期初期对病毒的产量有更好的感染循环.因此在下一步的工作中，可以在低DO、TOI为细胞生长对数期初期进行优化，可能获得更高的BV滴度和OV浓度.此外，本研究讨论了MOI、ICD、DO和TOI的相互关系及对病毒产量的影响.这为昆虫病毒杀虫剂的大规模生产提供了一定的根据.