《武汉工程大学学报》 2011年10期
22-24
出版日期：2011-11-30
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
壳寡糖硫酸盐对小鼠体内铁锌铜钙含量的影响
0引言壳聚糖是甲壳素脱乙酰产物，来源丰富，作为食品添加剂、保健食品、果汁处理剂［1］，已经被广泛用于食品行业.壳聚糖的单体氨基葡萄糖的盐酸盐和硫酸盐已在欧洲被使用预防和治疗骨关节炎有几十年历史，没有发现产生重要的毒副作用.哺乳动物奶水中的寡糖含有乙酰氨基葡萄糖单元.1983年美国FDA批准了壳聚糖作为饲料添加剂［2］，日本、韩国、西欧、美国、中国都有多种食品壳聚糖在销售.壳寡糖是聚合度小的壳聚糖，在生理pH条件下可溶，有许多有益的生理活性作用.上世纪八十年代科学家研究发现甲壳六聚糖和壳六聚糖对小鼠移植性癌细胞有明显的抑制作用［3］.经过研究已显示相对分子质量为5 000的水溶性壳聚糖具有更好的抗肿瘤及免疫促进作用［4］.壳寡糖工业化制备的方法主要是采用酶催化水解，一般将壳聚糖原料先溶解在醋酸、柠檬酸、乳酸等弱酸溶液中，进行水解，所得产物经超滤膜分离，然后冷冻干燥，产物是壳寡糖的弱酸盐.不过，这些产品的货架寿命短，在较高气温条件下易变成棕黑色，失去其水溶性和活性.研究发现壳寡糖的盐酸盐比壳寡糖的弱酸盐稳定，易于产品保存［5］.但是壳寡糖盐酸盐中引入氯离子，不适宜于心血管病及肾病患者，所以，将壳寡糖制备成壳寡糖硫酸盐，从而克服壳寡糖弱酸盐和盐酸盐的不足之处.作为一种新的壳聚糖产品，研究其生理活性作用很有必要.由于壳寡糖硫酸盐与金属离子的络合能力较强，又含硫酸根，而铁、锌、铜和钙都是生命体中重要的元素，探讨摄食壳寡糖硫酸盐对小鼠体内器官中铁、锌、铜和钙含量的影响确有必要.1材料与方法1.1材料与仪器壳聚糖原料由浙江金壳生物化学有限公司提供，壳寡糖硫酸盐由本实验室采用壳聚糖用酶降解制备所得的壳寡糖［6］，产品重均分子量Mw约为3×103.65%浓的HNO3为优级纯试剂，其他试剂均为分析纯.昆明小鼠和其食用的基础饲料（19.1%粗蛋白,12.13%氨基酸,4.80%粗纤维,4.25%粗脂肪,1.08%钙,41.77 mg/kg磷,164.1 mg/kg铁和54.12 mg/kg锌），由湖北省实验动物中心提供.TAS986原子吸收分光光度计是北京普析通用仪器有限责任公司产品.铅空心阴极灯是北京曙光明电子光源仪器有限公司产品.1.2实验方法
1.2.1急性毒性试验以5 g/kg体重灌胃剂量配制样品浓度.取昆明小鼠40只，分成2组，每组20只，雌雄各半，以每笼5只饲养.一组作为对照组.样品实验组每只小鼠被灌胃样品溶液0.2 mL后，观察小鼠的死亡情况、食量、活动状况和体重变化.
1.2.2喂食小鼠壳寡糖硫酸盐对其体内铁、锌、铜和钙含量影响的实验将20只雌性小鼠，随机分为2组（每组10只），其中一组为空白对照组，仅喂食小鼠基础饲料；样品组喂食含0.75%壳寡糖硫酸盐的基础饲料，观察小鼠的死亡情况、食量、活动状况和体重变化，第30天将小鼠断头致死，取出肝脏、肾脏、脾脏和心脏等器官，观察，称重.并采取一定量的肝脏，通过石蜡切片和染色，观察喂食样品对小鼠肝细胞的影响.称取0.1~0.2 g取出的脏器，向其中加1.0 mL高氯酸，5.0 mL浓硝酸加热消化，冷却后定容至10.00 mL.采用金属离子标准液制定标准曲线，用火焰原子吸收分光光度计测定样品中金属元素的含量（乙炔气流量：1.6 L/min;钙:3.0 mA,0.4 nm,422.7 nm;锌:3.0 mA,0.4 nm,213.89 nm;铁:4.0 mA,0.2 nm,248.3 nm;铜:3.0 mA,0.4 nm,324.7 nm）.最后采用t测验的方法比较实验组与对照组的差异.2结果与分析2.1急性毒性根据前期研究结果，小鼠对壳寡糖的最大耐受量大于10 g/kg体重［7］.本实验仅选择5 g/kg体重剂量配制样品浓度对小鼠灌胃，相当于成年人的拟口服用量为4~6 g/d［8］.在7天观察期内没有发现小鼠出现明显的中毒症状和死亡，小鼠食量没有改变，活动和其它行为如常，毛色光亮贴身，体重正常增加，说明壳寡糖硫酸盐对小鼠没有急性毒性.2.2喂食小鼠壳寡糖硫酸盐对其体内铁、锌、铜
和钙含量影响添加0.75%壳寡糖硫酸盐(COS)的饲料对小鼠进行30天的喂养.一个月内的观察发现小鼠的食量没有改变，各试验组动物反应灵敏且活动正常，毛色光亮贴身，体重正常增加，其体重变化如表1所示.样品组比对照组的体重略高，但是均无统计学意义，体重变化无显著性差异(P>0.05).第10期汪连生，等：壳寡糖硫酸盐对小鼠体内铁锌铜钙含量的影响
武汉工程大学学报第33卷
表1小鼠体重的变化(X±S/g,n=10)
Table 1Body weight changes of mice(X±S/g,n=10)
组别始重终重CK18.62±0.9132.77±2.27COS19.05±0.7834.11±2.87表2是喂养30天后小鼠的脏器指数，可以看出对肝、肺、心、肾等的脏器指数没有明显影响.喂食壳寡糖硫酸盐的小鼠的脾和胸腺指数有明显增加.胸腺、脾脏是动物体内主要的免疫器官，免疫器官的重量是反映机体非特异性免疫功能的重要而直观的指标.说明喂食壳寡糖硫酸盐可能提高小鼠免疫功能.把随机分离出来的肝脏经固定、浸蜡、包埋和切片后,各随机抽出10组染色制片,分别在显微镜下经高倍镜观察.根据在显微镜下观察到的结果拍下的照片表明，对照组与样品组肝细胞核膜完整，核仁清晰，胞浆正常，肝组织没有明显的病理改变.表2小鼠脏器指数
Table 2Organ/body weight index of the mice (body weight)mg·g-1
组别肝肺心脾胸腺肾CK51.8±4.26.2±1.74.6±1.12.7±0.71.9±0.811.7±1.5COS56.3±3.36.1±1.45.0±0.53.8±1.3*2.7±0.5*11.6±1.2注：*P< 0.05.表3显示了摄食壳寡糖硫酸盐的小鼠与对照组小鼠器官中铁、锌、铜和钙含量情况.摄食壳寡糖硫酸盐的小鼠肝、肺、心脏器官中铁含量与对照组相比有所上升，但是没有统计学意义（P>0.05）,脾、胸腺和肾脏中含量降低，有统计学意义（P<0.05）；摄食壳寡糖硫酸盐的小鼠脾和胸腺中锌含量与对照组相比有降低，有统计学意义，其他器官中锌含量变化没有统计学意义（P>0.05）；摄食壳寡糖硫酸盐的小鼠肝和肾脏中铜含量有所上升，有统计学意义（P<0.05），其他器官中锌含量变化没有统计学意义（P>0.05）；摄食壳寡糖硫酸盐的小鼠中肝和脾中钙含量降低，有统计学意义（P<0.05），严重影响钙吸收.表3小鼠器官中铁、锌、铜和钙含量
Table 3The levels of Fe,Zn,Cu and Ca in organs of the mice (organ,X±S,n=10)μg·g-1
元素组别肝肺心脾胸腺肾FeCK212.6±112.4409.4±219.0269.9±156.6813.0±297.2653.7±258.6264.1±79.5COS226.7±139.1473.1±250.3311.1±156.1528.6±164.1*372.3±238.9*131.8±82.3*ZnCK23.17±4.2933.87±11.9821.43±4.0245.08±13.4363.62±33.4917.88±2.43COS22.89±4.0325.48±10.1821.91±2.4123.55±7.68*36.80±11.90*17.34±3.56CuCK2.44±0.393.78±0.926.58±1.467.53±2.071.48±0.593.28±0.28COS3.11±0.38*3.44±0.896.16±0.644.81±1.482.21±0.393.78±0.48*CaCK261.6±152.9440.8±297.9142.2±95.71232.5±616.11374.8±551.2183.6±120.9COS79.6±39.2*404.9±118.5152.2±84.3450.3±287.2*731.7±434.9129.5±67.3注：*P< 0.05.3结语哺乳动物体内所需的金属元素主要由小肠从消化后的食物中吸收后进入血液.一些植物成分如植酸、酚类物质对一些矿物质金属元素的体内吸收有很强阻碍作用［910］.金属元素以可溶性形态存在容易被吸收.钙和铜是吸收利用率较高的元素，而锌和铁的吸收利用率较差［11］，体内所需铜的含量远低于锌、铁和钙，因而在喂养小鼠的饲料中锌、铁和钙含量较高.哺乳动物体内所需铜元素含量易于从普通饲料中满足，不易受到饮食纤维的阻碍而影响正常水平［12］.壳寡糖是可溶的，与这四种金属元素的配合物也是可溶的，且小分子壳寡糖可以被肠道吸收，少量摄食不会对铁、锌和铜的吸收有阻碍作用［13］.另外，壳寡糖有利肠道益生菌的生长，促使营养物质的吸收.壳寡糖硫酸盐是可溶的，在溶液中可以电离出硫酸根阴离子和壳寡糖的阳离子，由于硫酸钙溶解性较弱，壳寡糖硫酸盐与饲料一起食用，降低了钙的吸收，而铁、锌和铜的硫酸盐是可溶的，不会因引入硫酸根后其吸收受到明显影响.为了避免钙吸收降低，壳寡糖硫酸盐与食物的摄取需要间隔进行.因此，摄食壳寡糖硫酸盐不会明显影响体内铁、锌和铜的吸收，但是摄食壳寡糖硫酸盐期间需要补钙，进一步详细的研究有待进行.