《武汉工程大学学报》  2010年12期 1-5   出版日期：2010-12-31   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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中药茜草根乙酸乙酯萃取物的分离及抗氧化活性研究


0引言自由基及其诱导的氧化反应可损害机体的组织和细胞,导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病,而抗氧化活性物质可以减少和清除自由基,具有延缓人体衰老、防治疾病的作用［13］.研究发现,中草药对人体的多种疾病具有很好的治疗、预防等药理作用及保健功能,而其独特疗效与其抗氧化能力有密切的关系［45］.因此天然抗氧化物质的研究备受广大学者的关注［67］.中药茜草为茜草科植物茜草(Rubia Cordifolia L.)的干燥根及茎,又名活血草［8］.在我国大部分地区均有分布,其中以陕西渭南、河北邢台、河南洛阳等产地为最佳［9］.茜草根长期以来作为天然染料和药用植物使用,其生物活性主要有抗氧化、止血、抗肿瘤、抗菌、抗癌、增强免疫、护肝、抑制人体表皮细胞增殖等［1015］.中药茜草根化学成分复杂,到目前为止,对茜草根抗氧化活性的研究多集中在总提取物,而对于其分离纯化后较纯组分的生物活性的研究鲜有报道.本研究选取中药茜草根乙酸乙酯萃取物为研究对象,采用吸附柱层析法分离,通过改变洗脱条件,分离得到中药茜草根乙酸乙酯萃取物中较纯的组分,并测定其抗氧化活性,为中药茜草根乙酸乙酯萃取物中抗氧化活性部位的进一步筛选奠定了基础.1实验部分1.1主要试剂与仪器中药茜草根乙酸乙酯萃取物(深褐色膏状)由香港中文大学中医学院提供;2,4,6(2吡啶)1,3,5三嗪(2,4,6tripyridylstrizin,TPTZ,Fluka);二苯代苦味酰基自由基(1,1dipheny2picrylhydrazyl,DPPH·,Sigma);硫代巴比妥酸(上海纯晶);无水乙醇(优级纯);蛋黄卵磷脂、硫酸亚铁、氯化高铁、抗坏血酸(Vc)、醋酸钠、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司,分析纯);Komarowsky试剂(13 mL 50% (v/v)硫酸液与10 mL 2%(w/v)对羟基苯甲醛混合);FRAP工作液(25 mL 300 mmol/L醋酸盐缓冲液,2.5 mL 10 mmoL/L TPTZ,2.5 mL 20 mmol/L FeCl3混合);TBA溶液(3 g TBA,120 g TCA和10.4 mL HClO4溶于800 mL蒸馏水);石油醚、环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇(天津市东丽区天大化学试剂厂,分析纯);丙酮(分析纯);722E可见分光光度计(天津市普瑞斯仪器有限公司);ZF20D暗箱式紫外分析仪、旋转蒸发器RE200A(巩义市予华仪器有限责任公司);低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司);HC201恒温槽(重庆银河试验仪器有限公司);TG16I台式高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司).第12期杨红红,等：中药茜草根乙酸乙酯萃取物的分离及抗氧化活性研究
武汉工程大学学报第32卷
1.2中药茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ的分离本实验运用吸附柱色谱,以粗孔层析硅胶(zcxⅡ,75~150 μm)为吸附剂,采用干法装柱,梯度洗脱.通过薄层色谱法确定吸附柱层析的洗脱体系,分离和纯化茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ,其分离流程如图1所示.图1茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ分离流程图
Fig.1Separation flow chart of the ethyl acetate extraction of Rubia cordifolia L1.3洗脱体系的确定根据吸附与解吸的平衡的原理,采用薄层色谱法确定吸附柱层析法的洗脱体系以达到最佳分离效果.以组分ⅣAGJT分离得到较纯组分VAGJT为例.组分ⅣAGJT为中药茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ经三次柱层析分离得到的组分,三次洗脱条件依次为:石油醚乙酸乙酯配比(7030),环己烷乙酸乙酯配比(6040),二氯甲烷丙酮配比(973).
1.3.1确定最佳洗脱剂系统配比溶剂常用有机溶剂石油醚、环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇极性依次递增,根据较小极性溶剂与较大极性溶剂配比原则,确定九种展开剂:二氯甲烷乙酸乙酯(955)、二氯甲烷丙酮(964)、二氯甲烷甲醇(991)、环己烷乙酸乙酯(6040)、环己烷丙酮(7030)、环己烷甲醇(8020)、石油醚乙酸乙酯(4060)、石油醚丙酮(5050)、石油醚甲醇(6040),依次标记为1~9.将组分ⅣAGJ点样于九块薄层色谱板,均呈带状,分别轻放入展开剂1~9中展开.待展开完成后将色谱板取出,晾干,在紫外灯下观察;再喷以Komarowsky显色剂于110 ℃烘干显色,观察分离效果.
1.3.2确定洗脱剂系统极性递增配比根据1.3.1实验结果选取石油醚丙酮展开体系配制展开剂石油醚、石油醚丙酮(9010、8020、7030、6040),依次标记为10~14,点板,展开,显色,观察分离效果.将薄层层析中使第一个斑点Rf=0.2左右时的配比极性确定为起点,使最后斑点Rf=0.2左右时的配比极性确定为终点.再根据上述实验结果配制展开剂石油醚丙酮(9010、8515、8218、8020、7822、7525、7228、7030),依次标记为15~22,点板,展开,显色,观察分离效果.1.4抗氧化活性测定
1.4.1样品溶液的制备将茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ及组分VAGJT于45 ℃真空干燥,用无水乙醇配制5 mg/mL的溶液备用.
1.4.2总抗氧化活性的测定采用铁还原/抗氧化能力(Ferric reducing/antioxidant power,FRAP)分析法评估样品的总抗氧化活性.其基本原理是:在较低pH环境下,抗氧化物质将Fe3+还原为Fe2+,Fe2+与三吡啶三吖嗪(2,4,6tripyridylstrizi,TPTZ)结合生成的蓝色络合物于593 nm处有最大光吸收.反应体系包括3 mL FRAP工作液,100 μL样品溶液,混匀反应5 min,于593 nm处测定吸光度,以FRAP工作液调零.平行测定两次,取平均值.绘制FeSO4标准曲线,由样品吸光值确定其相应的FeSO4的浓度(μmol/L),即为FRAP值.FRAP值越大,表明被抗氧化物质还原得到的Fe2+越多,即抗氧化活性越强［16］.
1.4.3抗脂质过氧化活性的测定采用硫代巴比妥酸(2Thiobarbituric Acid,TBA)法测定样品抗脂质过氧化活性,由于Fe2+/抗坏血酸诱导的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成一种粉红色化合物,并于532 nm处有最大光吸收.反应体系包括20 μL FeSO4(0.075 mol/L)、20 μL抗坏血酸溶液(0.1 mol/L)、50 μL蛋黄卵磷脂溶液(0.03 g/mL)、不同体积样品溶液,用磷酸缓冲溶液(pH=7.4)定容至4 mL,充分混匀,37 ℃水浴中1 h,分别加入0.2 mL EDTA(0.1 mol/L)和1.5 mL TBA溶液,充分混匀,沸水浴15 min后取出迅速冷却,3 000 r/min离心10 min.于532 nm处测定其吸光度,以PBS溶液作空白试剂.平行测定三次,取平均值.根据吸光值按公式(1)计算抑制率(%).再由样品的不同浓度和其对应的抑制率计算其50%抑制浓度,即IC50值.IC50值越低,其抗脂质过氧化活性越强.抑制率(%)=(Ac－Ai)/Ac×100%(1)
式中,Ac为未加入样品溶液反应体系的吸光度;
Ai为不同浓度样品溶液反应体系的吸光度.
1.4.4清除自由基能力的测定DPPH·(1,1dipheny2picrylhydrazyl)是一种稳定的自由基,在517 nm处有强吸收.当有自由基消除剂存在时,DPPH·的单电子被配对而使颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度变小,而且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系.反应体系包括400 μL 0.4 mg/mL DPPH溶液,不同体积样品溶液,用无水乙醇定容至4 mL.混合均匀,黑暗下室温避光反应30 min,于517 nm处测定其吸光度,以无水乙醇溶液作空白试剂.平行测定三次,取平均值.由(1)式计算抑制率(%),再计算IC50值,IC50值越低,其清除自由基能力越强.2结果与讨论2.1薄层色谱分析洗脱体系的选择在柱层析分离过程中洗脱体系的选择直接影响样品分离的效率.用硅胶薄层色谱分析可直接判断洗脱体系的选择是否合适.本文以组分ⅣAGJ为例,其柱层析分离的洗脱体系选择实验结果如图2所示:
图2确定洗脱系统的TLC显色图谱.(a)确定最佳洗脱系统配比溶剂; (b)确定洗脱系统极性起点与终点; (c)确定洗脱系统极性递增比例
Fig.2TLC photographs to determine the washsolvent system;(a)determination of the optimal solvent volume ratio;(b)determination of the jumpingoff point and endpoint of polarity;(c)determination of the polarity increment of the washsolvent system2.1.1最佳洗脱系统配比溶剂的选择在最佳洗脱系统配比溶剂确定实验中,依次配比了九组展开剂,观察发现6号和9号展开剂不互溶,不适合作为洗脱系统.如图2(a)所示,1、2、3、4和7号均只能看到混杂的红色斑点,而5号和8号可以明显观察到蓝色及红色斑点分离,可知含有丙酮溶剂的展开剂分离效果较好.5号与8号相比较,8号蓝色斑点段可以观察到两个分离的斑点.结果表明:8号展开剂为组分ⅣAGJ柱层析洗脱的最佳洗脱系统,即石油醚丙酮展开体系.
2.1.2洗脱系统溶剂递增比例的确定由图2(b)中10~14号显色结果可确定组分ⅣAGJ洗脱剂的极性起点为石油醚丙酮(9010),终点为石油醚丙酮(7030).在此基础上进一步改变展开剂配比.根据图2(c)显色结果确定其柱层析洗脱剂极性递增比例为:石油醚、石油醚丙酮(8515、8218、8020、7822、7525、7228、7030)、甲醇,且其显色结果表明该洗脱体系能较好分离组分VAGJT.采用同样的方法确定了前三次柱层析分离的洗脱体系,依次为:石油醚、石油醚乙酸乙酯(955、9010、8020、7030、5050)、甲醇;环己烷乙酸乙酯(7030、6040、5545、5050)、乙酸乙酯;二氯甲烷、二氯甲烷丙酮(991、982、973、955、9010)、甲醇.2.2VAGJT成分分析取组分VAGJT点样于硅胶薄层色谱板(UV254),以环己烷丙酮(7030)为展开剂,展开,晾干,显色.高效液相色谱用十八烷基键合硅胶为填充剂;以水乙腈为流动相梯度洗脱;流速1 mL/min,04060 min,乙腈比例0100%100%;柱温25 ℃;检测波长210 nm.结果如图3所示.TLC显色结果为一樱红色斑点.HPLC图谱显示有三个强信号峰,即该样品有三种主要成分,且其保留时间相差小,说明组分VAGJT不是单一成分.图3VAGJT样品薄层色谱(a)及高效液相(b)图谱
Fig.3The TLC and HPLC of VAGJT2.3抗氧化活性
2.3.1总抗氧化活性首先测定FeSO4·7H2O标准曲线,其结果如图4所示.回归线性方程为:Y=0.019X+0.073,R=0.997 0,SD=0.019 89,P<0.001.图4Fe2+标准曲线
Fig.4Standard curve of Fe2+由标准曲线得到与样品相对应的FRAP值Fe2+浓度(μmol/L),FRAP值越大,表明其总抗氧化能力越强.组分VAGJT、茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ及阳性对照Vc的A593分别为1.019,0.628,1.937,则对应的FRAP值Fe2+浓度分别为49.79 μmol/L,29.21 μmol/L,98.11 μmol/L.结果表明组分VAGJT的总抗氧化能力优于茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ.
2.3.2抗脂质过氧化活性TBA法测定组分VAGJT及茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ抗脂质过氧化活性结果见表1.表1TBA法测定组分VAGJT及
Ⅰ抗脂质过氧化活性(抑制率/%)
Table 1Inhibition rate of VAGJT and Ⅰ by TBA assay
质量浓度／
(μg·mL-1)VAGJTⅠVc1.566.71±2.8928.02±3.327.78±3.153.1316.06±1.7443.02±2.9614.99±0.246.2534.35±1.2156.39±2.2119.84±2.2112.558.86±2.4761.86±2.8325.67±2.432575.41±0.8169.77±0.6640.94±2.36IC5010.34±0.785.58±0.9446.02±1.38根据结果可知组分VAGJT及茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ抗脂质过氧化的IC50值均小于Vc,表明组分VAGJT及茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ的抗脂质过氧化活性均强于Vc.
2.3.3清除自由基能力用DPPH法测定组分VAGJT及茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ清除自由基能力结果见表2.结果显示组分VAGJT的IC50值低于茜草根乙酸乙酯萃取物Ⅰ且均大于Vc,说明组分VAGJT清除自由基能力优于茜草根乙酸乙酯萃取Ⅰ,且均不及Vc.表2DPPH法测定组分VAGJT及
Ⅰ清除自由基能力(抑制率/%)
Table 2Inhibition rate of VAGJT and Ⅰ by DPPH assay
质量浓度／
(μg·mL-1)VAGJTⅠVc1.5611.67±4.053.91±0.1634.37±1.533.1324.43±2.8110.67±0.7672.97±0.626.2541.44±2.9121.74±1.0994.28±0.1212.558.30±2.0643.64±0.8995.99±0.102569.42±1.7269.49±0.3396.33±0.07IC509.85±1.1514.55±0.371.66±0.06综上可知,经四次柱层析分离得到的组分VAGJT可能含有三种主要成分,其抗氧化活性较优于茜草根乙酸乙酯总提取物,可能为其活性抗氧化成分,这一研究结果可为后续抗氧化成分的分离提供有力的实验数据.3结语中药茜草根乙酸乙酯萃取物具有较好的抗氧化活性,其抗脂质过氧化活性尤为突出;从茜草根萃取物中分离得到的组分VAGJT也具有较强的抗氧化能力,尤其在铁还原能力及清除自由基能力方面活性较优,但其抗脂质过氧化能力不及总提取物.这一结果表明可根据此活性追踪进一步研究中药茜草根萃取物中最优抗氧化活性的成分.