《武汉工程大学学报》 2009年05期
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出版日期：2009-05-28
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
不同周期Sf9细胞琥珀酸脱氢酶酶活的研究
0引言MTT法的基本原理是活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶能将染MTT（四甲基偶氮唑盐）转变为不溶的紫色甲臜颗粒，后者的生成量与细胞数目和细胞活性呈正相关，用二甲亚砜（DMSO）溶解所生成的甲臜，通过酶标仪检测OD值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性［15］.由于该法稳定客观，没有放射性损伤和污染问题，所以常被用来推测活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力或推算病毒滴度［69］.在活细胞数量相等而细胞生长状态却不同的情况下OD值是否还会一样，即在细胞生长活力不同的情况下线粒体内琥珀酸脱氢酶的酶活是否相同.因此笔者设计了以下两个实验：1.利用细胞周期同步化方法先将Sf9细胞同步化于G1/S期，在恢复生长不同的时间段分别得到S、G2/M、G1期的细胞，然后使用MTT法测三个周期内细胞的OD值.2.在一条细胞生长曲线上的潜伏期，指数生长期，平稳期，衰亡期分别采样， 以MTT法测OD值来判断其酶活大小.同时，通过FCM检测每个样G1、S、G2/M的周期分布，以进一步研究细胞周期对琥珀酸脱氢酶活的影响.1实验部分1.1细胞草地夜蛾细胞（Sf9）购于中国典型培养物保藏中心.1.2试剂及仪器Graces培养基、胎牛血清均购于GIBCO公司.胸腺嘧啶核苷为北京欣经科生物技术有限公司产品.Multiskan MK3酶标仪由热电仪器有限公司生产.BECKMAN公司EPIC5 ALTRAⅡ型流式细胞仪.1.3细胞培养Sf9细胞以Graces培养基（含体积分数为10%胎牛血清）贴壁传代培养.待细胞生长良好时转入摇瓶培养（27 ℃，80 r/min）.接种浓度为1.5×105个/mL，细胞存活率＞95%.1.4MTT法测酶活用体积分数为10%胎牛血清的Graces培养液将Sf9细胞接种于96孔板，每孔100 μL，调整设置接种细胞数目在1.0×104~1.0×105 个/孔之间（例如5.0×104、3.5×104、2.5×104、1.5×104），并设培养液空白组.同时每孔加入30 μL（5 mg/mL）MTT.置27 ℃培养箱振荡培养4 h，平板离心机2 000 r/min离心10 min后弃上清. 加100 μL二甲基亚砜振荡10 min，在酶标仪上570 nm处测OD值.1.5细胞周期同步化方法采用胸腺嘧啶核苷双阻断法阻断细胞于G1/S期之间（Sf9细胞大概需要6 h穿过G1期，6~7 h跨过S期，6~7 h走过G2/M期）［10］.简要步骤如下： 取处于对数生长期的Sf9细胞加入胸腺嘧啶核苷（Thymidine）至其终浓度为2 mmol·L1，培养16 h， 1000 r/min离心10 min后弃去培养液，以PBS液清洗细胞后加入新鲜培养液培10 h， 再次加入胸腺嘧啶核苷至其终浓度为2 mmol·L-1，培养16 h，弃去培养液， 以PBS液清洗细胞后加入新鲜培养液恢复生长.1.6流式细胞仪检测样品的制备及流式测试 所有样品均从摇瓶中吸取0.8 mL的细胞悬液，离心弃上清，先加入BECKMAN公司PI试剂盒中的DNA PREP LPR 100 μL于微型漩涡混合仪上混匀10 s，再加入DNA PREP Stain 1 mL同样置于微型漩涡混合仪上混匀10 s， 然后放入4 ℃冰箱保存备用.上流式前从4 ℃冰箱内取出样品，避光37 ℃放置5 min.异于正常Sf9细胞大小的物质与粘黏的细胞被排除在“门”之外.每个样品至少计数1×104个细胞以上.对DNA直方图的分析采用ModFit软件.2结果与讨论2.1不同细胞周期Sf9细胞酶活的测定图1表示出以MTT法检测不同细胞周期Sf9细胞的OD值.Sf9细胞经过胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化后，经流式检测其同步化率为91.2%.然后从0 h开始释放，分别在释放后1 h、7 h、15 h从摇瓶内采样做MTT. 图1中三个期的直线方程分别如下.G1：y=0.010 3 x+0.017 8，R2=0.998 5；S：y=0.008 4x+0.026 4，R2=0.9934；G2/M：y=0.0064x+0.0211，R2=0.992 4.图1说明，在相对细胞数量相等的情况下，代表G1期直线的斜率＞代表S期直线的斜率＞代表G2/M期直线的斜率，这一结果表明G1期的细胞酶活是最大的.图1MTT法测不同细胞周期Sf9细胞OD值
Fig.1OD value of Sf9 cells at different cell cycles using MTT第5期张佑红，等：不同周期Sf9细胞琥珀酸脱氢酶酶活的研究
武汉工程大学学报第31卷
2.2不同生长周期Sf9细胞酶活的测定图2为Sf9细胞生长曲线，从接种0 h开始，每隔24 h采样进行细胞计数，取三次计数的平均值.图2Sf9细胞生长曲线
Fig.2The concentration of Sf9 cells in different growth phase图3表示用MTT法测不同生长周期Sf9细胞的OD值.Sf9细胞接种24 h后（图2），开始采样并以MTT法测OD值（此时细胞处于对数生长期初期），以后每隔24 h采样做MTT直至细胞进入衰亡期.图3中代表各个时期的直线方程分别如下.24 h：y=0.006 2x+0.007 4，R2=0.998 2；48 h：y=0.009 5x+0.012 1，R2=0.997 3；72 h：y=0.006 3x+0.026 2，R2 = 0.999 6；96 h：y=0.005 5x+0.013 4，R2=0.994 7.从图3上的直线以及直线方程可知接种后48 h时，也就是细胞处于指数生长中期时的直线斜率最大，即此时的细胞酶活是最大的.图3MTT法测不同生长周期Sf9细胞OD值
Fig.3OD value of Sf9 cells at different hours of growth curve2.3Sf9细胞周期分布的测定 自接种24 h开始每隔24 h采样，进行流式的样品制备及流式测试与分析.具体的流式分析数据如表1所示.表1Sf9细胞周期分布
Table 1Distribution of Sf9 cell cycles at different time of growth
t/hG1期/%S期/%G2/M期/%2416.9038.2044.904818.4045.8035.80729.8832.1058.029611.6020.0068.40从表1可知，在接种后48 h处的Sf9细胞处在G1和S期所占的比例相对于其它时间点是最大的.MTT法被广泛应用到细胞生物学、生物医学等的诸多领域中，虽然该法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，但重复性不高这一缺点也较为明显.即在实验过程中，人为操作或环境因素的稍稍改变均会对最后的结果造成较大影响.因此，为了得到真实、可信的实验结果，笔者多次重复本实验并发现：在实验2.1中，所有的数据均显示出琥珀酸脱氢酶酶活（以时期表示）为G1＞S＞G2/M这一规律.而在实验2.2中，接种后48 h时的细胞酶活明显大于其他时间的细胞酶活，同时，通过FCM分析我们发现此时处于G1和S期的细胞相对其他时间处于G1和S期的细胞最多，这一现象正好和实验2.3的结论相互印证.3结语实验证明，G1期的细胞琥珀酸脱氢酶酶活要大于S期的细胞酶活， S期的细胞酶活又大于G2/M期的细胞酶活，相应的，位于接种后48 h的细胞酶活最大，而此时正处于指数生长期中生长最旺盛的时期，其处于G1、S期的细胞所占比例相对于其它时间处于G1、S期的细胞为最大.因此，证明了不同周期Sf9细胞与其琥珀酸脱氢酶酶活之间存在着紧密联系.