微生物是土壤中最为丰富多样的生物种群，在维持生态平衡、驱动生物地球化学循环等方面起着重要作用［15］。微生物群落的变化可以反映土壤污染物的生态胁迫效应［16-17］。环境中的AgNPs会不同程度地改变微生物活性和群落结构。Peixoto等［18］研究了AgNPs长期暴露对土壤细菌群落的影响，发现暴露56 d后细菌群落结构与对照组相比仅有71.9%的相似性。Montes等［19］发现AgNPs在预测环境质量分数下使土壤微生物生物量有所下降。Samarajeewa等［20］通过一系列微生物测试评估了沙壤土中聚乙烯吡咯烷酮包被的AgNPs（3~706 mg·kg-1）对微生物生长、活性和多样性的影响，结果表明AgNPs对土壤微生物群落活性有显著的抑制作用，而且毒性随着时间的推移变得更加明显。

磷脂是含有磷酸基团的脂质，是生物细胞膜的主要成分。不同微生物具有不同种类的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA），其含量和结构具有种属特征或与其分类密切相关，能够标志某种或某类特定微生物的存在［21］。不同微生物群落具有独特的PLFA特征谱图，因此PLFA可以用于对微生物群落进行识别和定量描述，PLFA的变化反映了环境样品中微生物群落结构的变化［22］。此外，由于磷脂不能作为细胞的贮存物质，微生物细胞死亡后，其中的磷脂化合物会迅速降解，因而PLFA可以代表微生物群落中的活性微生物［23］。使用PLFA鉴定微生物种类并定量分析微生物群落生物量和群落结构，克服了传统微生物培养及计数方法的缺点，具有较高的准确性、稳定性和敏感性［24］，被广泛应用于土壤微生物群落研究［25］。

目前，关于不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA变化的研究较少。因此，本研究以农田土壤为研究体系，对不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA含量、丰度及群落结构的变化趋势进行分析，探究土壤微生物PLFA对AgNPs胁迫的响应特征。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

1.1.1 主要试剂 纳米银粒子（上海麦克林生化科技股份有限公司，纯度为99.5%，粒径为60~120 nm）。使用的化学试剂主要包括：乙酸（分析纯），氢氧化钾（分析纯），一水合柠檬酸（分析纯），二水合柠檬酸三钠（分析纯），氯仿（色谱纯），丙酮（色谱纯），正己烷（色谱纯），甲醇（色谱纯），甲苯（色谱纯）；以上试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 供试土壤 土壤采集自甘肃定西的旱地农田。采用对角线布点法采集3个子样，每个子样点从上至下铲取0~15 cm表层土壤，充分混匀后采用四分法保留5 kg土壤。使用孔径为2 mm的土壤筛清除土壤中的植物残体和砾石，储存在4 ℃下。实验开始前，所有土壤样品在25 ℃下避光预培养7 d，使土壤微生物从干扰中恢复活性。

土壤样品具有以下特性：土壤总有机碳含量为4.70 g·kg-1，总氮含量为0.40 g·kg-1；土壤铵态氮含量为1.19 mg·kg-1，硝态氮含量为65.05 mg·kg-1；土壤pH值（土水质量比为1.0∶2.5）为8.34；土壤质地为粉壤土，其中砂粒（0.02~2.00 mm）质量分数为28%，粉粒（0.002~0.020 mm）质量分数为68%，粘粒（< 0.002 mm）质量分数为4%。

1.2 方 法

1.2.1 实验设计 本研究设计在土壤中添加10、100、1 000 mg·kg-1 AgNPs（Ag10组，Ag100组，Ag1 000组），并以未添加AgNPs的土壤作为对照组（CK组），共计4种处理，每种处理设置3个平行样品。AgNPs以粉末形式添加到土壤中；首先向空白土壤加入质量分数10 g·kg-1AgNPs，使用搅拌装置持续混合10 min；然后采用10倍稀释法［26］，对含有10 g·kg-1AgNPs的土壤进行“稀释”，添加空白土壤使其依次达到目标质量分数，每次“稀释”后使用搅拌装置充分混合。建立微宇宙土壤培养体系，将10 g含有目标质量分数AgNPs的土壤放入培养瓶，置于生化培养箱（LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司）中25 ℃下避光培养56 d。每隔2 d向土壤中补充无菌去离子水，采用差量法使土壤水分维持在土壤持水量的60%。

1.2.2 微生物PLFA的提取和检测 将土壤样品在-80 ℃下冷冻12 h，使用冷冻干燥机（FreeZone，美国Labconco公司）冻干48 h。采用改良的Bligh-Dyer法提取土壤微生物PLFA［27］，包括提取脂类、分离磷脂和甲醇酯化3个步骤：（1）称取1.00 g冻干土壤样品，加入7.6 mL甲醇-氯仿-柠檬酸缓冲液（体积比2.0∶1.0∶0.8）进行萃取，50 r·min-1水平振荡2 h，1 500 r·min-1离心10 min；重复萃取1次。将上清液与6 mL氯仿和4.8 mL柠檬酸缓冲液混合，静置4 h，转移下层有机相并使用氮吹仪（DC-24，上海安谱实验科技股份有限公司）吹干。（2）加入5 mL氯仿溶解氮吹后的样品，并转移到固相萃取柱中，依次加入8 mL氯仿、10 mL丙酮和8 mL甲醇洗脱中性脂、糖脂和磷脂，收集磷脂。再加入200 μL 99.36 μmol·L-1十九烷酸甲酯作为内标物质，使用氮吹仪吹干。（3）加入1 mL甲醇甲苯混合溶液溶解氮吹后的样品，并加入1.0 mL 0.2 mol·L-1氢氧化钾甲醇溶液，37 ℃水浴15 min。加2.0 mL正己烷氯仿混合溶液、0.3 mL 1 mol·L-1乙酸溶液和2.0 mL无菌去离子水，50 r·min-1水平振荡10 min，以1 500 r·min-1速度离心10 min；重复提取1次。转移上层有机相并使用氮吹仪吹干。

加入正己烷溶解氮吹后的磷脂脂肪酸甲酯，使用MIDI全自动微生物鉴定系统（Sherlock，美国MIDI公司）和气相色谱仪（7890B，美国安捷伦科技有限公司）检测微生物PLFA。系统根据各组分的出峰时间和保留时间，与系统谱库中的标准数值相匹配，鉴定PLFA的种类。PLFA常见命名格式包括X：Y ωZ（c/t）、（i/a）X：0、X：0 cy、X：0 10Me等。其中，X表示碳原子数；Y表示双键数；ω表示甲基末端；Z表示双键到甲基端的距离；c/t分别表示顺式和反式；i/a分别表示异构和反异构支链；cy表示环丙烷脂肪酸；Me表示甲基［28］。

1.3 数据处理

1.3.1 微生物PLFA含量和多样性的计算 微生物PLFA含量采用峰面积归一化法计算：

mi = （Ai · ms ）/ （As / m） （1）

其中Ai为第i种特征PLFA的峰面积值，ms为内标物质的物质量，As为内标物质的峰面积值，m为土壤样品干重。

微生物PLFA的Shannon多样性指数（H）、Pielou均匀度指数（J）和Simpson优势度指数（D）计算公式［29］如下：

H = - [Pi] · lnPi （2）

J = - [Pi]· lnPi / lnS （3）

D = 1 - [P2i] （4）

其中Pi为第i种特征PLFA占总PLFA的比例；S为微生物群落中PLFA的频次。

1.3.2 统计分析 所有数据使用IBM SPSS Statistics 25进行统计分析，并使用Origin 2021进行绘图。采用单因素方差分析，在p < 0.050水平上进行最小显著性差异分析（least significant difference，LSD）。基于Spearman相关系数分析AgNPs质量分数与微生物PLFA之间的相关性。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）反映基于PLFA的微生物群落结构变化。采用Kruskal-Wallis秩和检验和Wilcoxon秩和检验检测PLFA丰度差异，并进行线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。

2 结果与讨论

2.1 微生物PLFA的种类

通过系统鉴定和计算，识别并筛选出相对含量大于1%的原核生物PLFA共23种（见表1）。其中细菌PLFA共12种，包括6种革兰氏阳性菌（gram-positive bacteria，G+）PLFA和6种革兰氏阴性菌（gram-negative bacteria，G-）PLFA；真菌PLFA共2种，包括1种普通真菌PLFA和1种丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）PLFA；放线菌PLFA共5种；通用PLFA共4种。

表1 纳米银胁迫下土壤微生物PLFA种类

Tab.1 Species of soil microbial PLFAs under AgNPs stress

[微生物类群 特征PLFA 细菌 革兰氏阳性菌 i15:0，a15:0，i16:0，

i17:1 ω9c，i17:0，a17:0 革兰氏阴性菌 16:1 ω7c，17:1 ω8c，17:0 cy ω7c，

18:1 ω7c，18:1 ω5c，19:0 cy ω7c 真菌 普通真菌 18:2 ω6c 丛枝菌根真菌 16:1 ω5c 放线菌 16:0 10Me ，17:1 ω7c 10Me，

17:0 10Me，18:1 ω7c 10Me，

18:0 10Me 通用 16:0，17:0，18:1 ω9c，18:0 ]

2.2 微生物PLFA的含量

如图1所示，相关性分析表明，微生物PLFA含量与AgNPs质量分数之间存在显著负相关（p < 0.050）。如图2所示，与对照组相比，Ag10组、Ag100组和Ag1 000组的微生物PLFA总含量、真菌、放线菌及G-的PLFA含量分别降低了11.2%~43.0%、14.4%~46.9%、8.6%~52.1%、14.9%~29.4%（p < 0.050）。此外，Ag10组的细菌、G+及AMF的PLFA含量与对照组之间没有显著差异（p > 0.050），而Ag100组和Ag1 000组的相应类群PLFA含量分别降低了25.9%~39.3%、40.4%~57.3%、33.1%~52.3%（p < 0.050）。

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-1.tif>[Simpson指数][Piclou指数][微生物总含量][真菌含量][细菌含量][放线菌含量][G+含量][G-含量][AMF含量][真菌丰度][细菌丰度][放线菌丰度][G-丰度][G+丰度][AMF丰度][真菌/细菌][G+/G-][Shannon指数][1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0][**][**][**][**][**][**][*][***][***][***][***][***][***][***][**][**]

注：G+，革兰氏阳性菌；G-，革兰氏阴性菌；AMF，丛枝菌根真菌；红色和蓝色分别表示正相关和负相关，扇形半径表示相关系数；*p < 0.050，**p < 0.010，***p < 0.001。

图1 AgNPs质量分数与土壤微生物PLFA含量、丰度及比值、多样性指数的Spearman相关性

Fig. 1 Spearman correlation between AgNPs mass fraction and content， abundance， ratio， and diversity index of soil microbial PLFA

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-2.tif>[总 真菌 细菌 放线菌 G+ G- AMF][30

20

10

0][微生物PLFA含量 / （mol/g）][a][c][d][a][b][a][c][a][b][c][d][a][a][c][b][a][bc][b][c][a][a][b][c][b][CK

Ag10

Ag100

Ag1000]

注：G+，革兰氏阳性菌；G-，革兰氏阴性菌；AMF，丛枝菌根真菌；误差条表示标准差，n = 3；不同字母表示显著性差异，LSD，p < 0.050。

图2 不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA含量

Fig. 2 Content of soil microbial PLFAs under different

levels of AgNPs stress

上述结果表明，AgNPs对微生物整体及各主要类群的生物量存在明显的剂量依赖性抑制作用。Xin等［30］发现，经过2个月的培养后，微生物生物量在200和500 mg·kg-1AgNPs暴露下均发生显著减少。Montes等［19］发现，在暴露于0.015、0.150、1.500 μg·kg-1AgNPs 60 d后，土壤中G+和放线菌生物量均有所下降。

2.3 微生物PLFA的丰度及其比值

如图1所示，相关性分析表明，细菌和G-的PLFA丰度与AgNPs质量分数之间存在显著正相关，放线菌、G+和AMF的PLFA丰度与AgNPs质量分数之间存在显著负相关，因此G+/G-丰度比值与AgNPs质量分数之间存在显著负相关（p < 0.050）；而真菌PLFA丰度及真菌/细菌丰度比值与AgNPs质量分数之间没有显著相关性（p > 0.050）。

如图3所示，与对照组相比，Ag10组的真菌、细菌、G-和AMF的PLFA丰度没有显著差异（p > 0.050）；Ag100组的真菌、细菌、G-的PLFA丰度分别升高了13.4%、4.7%、15.9%（p < 0.050），而AMF的PLFA丰度没有显著差异（p > 0.050）；Ag1 000组真菌和AMF的PLFA丰度则分别降低了7.2%、16.6%，而细菌和G-的PLFA丰度分别升高了6.4%、23.7%（p < 0.050）。此外，Ag10组放线菌和G+的PLFA丰度分别升高了3.0%、9.4%，而Ag100组和Ag1 000组的相应类群PLFA丰度分别降低了16.2%~16.7%、15.9%~25.1%（p < 0.050）。

[0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0][微生物PLFA相对丰度]<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-3.tif>[CK

Ag10

Ag100

Ag1000][真菌 细菌 放线菌 G+ G- AMF][b][a][c][bc][b][a][c][c][b][a][c][d][a][a][c][c][b][a][a][a][a][b]

注：G+，革兰氏阳性菌；G-，革兰氏阴性菌；AMF，丛枝菌根真菌；误差条表示标准差，n = 3；不同字母表示显著性差异，LSD，p < 0.050。

图3 不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA相对丰度

Fig. 3 Relative abundance of soil microbial PLFAs under

different levels of AgNPs stress

如图4所示，与对照组相比，Ag10组的G+/G-丰度比值升高了14.2%，而Ag100组和Ag1 000组降低了27.3%~39.4%（p < 0.050）。同时，Ag10组和Ag100组的真菌/细菌的丰度比值与对照组之间没有显著差异（p > 0.050），只有Ag1 000组降低了12.8%（p < 0.050）。

高质量分数AgNPs（100、1 000 mg·kg-1）暴露下，G-丰度显著升高。Liu等［31］发现，在1 mg·kg-1

AgNPs胁迫下，G-丰度增加，G+丰度减少。G-的耐受性可能归因于其细胞外膜的脂多糖，在银离子接触细胞时提供了一定的保护作用［32］。此外，Montes等［33］发现，暴露第60 d时，与细菌相比，真菌对AgNPs相对不敏感。这可能是由于真菌作为一种真核生物，对Ag+和重金属更具耐受性。Kumar等［34］发现在含0.066% AgNPs的土壤中，细菌PLFA减少，具有抗氧化特性的Hypocreales真菌占比从1%增加到70%。

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-4.tif>[0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0][微生物PLFA相对丰度][CK

Ag10

Ag100

Ag1000][真菌细菌 G+/G-][ab][b][a][c][c][d][a][b]

注：G+，革兰氏阳性菌；G-，革兰氏阴性菌；误差条表示标准差，n = 3；不同字母表示显著性差异，LSD，p < 0.050。

图4 不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA相对丰度比值

Fig.4 Ratios of soil microbal PLFA values under different

levels of AgNPs stress

2.4 微生物PLFA的多样性

如图1所示，相关性分析表明，微生物PLFA的Shannon指数、Pielou指数和Simpson指数与AgNPs质量分数之间均存在显著负相关（p < 0.050）。如图5所示，与对照组相比，Ag10组的多样性指数没有显著差异（p > 0.050），Ag100组和Ag1 000组的Shannon指数、Pielou指数和Simpson指数分别降低了1.9%~3.2%、0.9%~1.4%、1.9%~3.2%（p < 0.050）。

如图6所示，PCA坐标轴1和轴2对微生物群落结构的解释率分别为76.9%和10.8%。对照组与Ag10组之间的距离较为接近，表明低质量分数AgNPs（10 mg·kg-1）暴露引起的微生物群落组间差异较小。Ag100组和Ag1 000组与对照组在坐标轴1上的距离较远，且2个处理组之间的距离较为接近，表明高质量分数AgNPs引起微生物群落结构的显著变化。

随着AgNPs质量分数增加，微生物多样性逐渐下降，群落组间差异逐渐增大。Zou等［35］发现，高质量分数AgNPs处理组的Chao1指数和Shannon指数低于对照组；即使在30 d后，处理组多样性指数仍然未恢复到对照组水平。这种长期影响可能是由于AgNPs在土壤中的滞留和缓慢释放，AgNPs的毒性效应随着时间推移而增强［36］。微生物群落结构的变化主要是由于物种丰度发生变化，不同微生物物种对AgNPs的响应不同，银抗性较强的物种丰度升高，对银敏感的物种丰度下降。此外，群落结构的变化程度与AgNPs质量分数密切相关。Vasileiadis等［37］研究发现细菌16S和真菌ITS基因拷贝数的平均EC50为89.3和202.0 mg·kg-1。

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-5.tif>[2.95

2.90

2.85

2.80

2.75

2.70][Shannon指数][0.94

0.93

0.92

0.91][Pielou指数][0.93

0.92

0.91

0.90

0.89

0.880.87

][Simpson指数][CK

Ag10

Ag100

Ag1000][CK

Ag10

Ag100

Ag1000][CK

Ag10

Ag100

Ag1000][b][a][c]

注：箱体内水平条表示中位数，箱体上下边缘分别表示上下四分位数，上下须线长度为1.5倍标准差，n = 3；*表示显著性差异，LSD，* p < 0.050，** p < 0.010，*** p < 0.001。

图5 不同水平AgNPs胁迫下土壤微生物PLFA多样性

指数

Fig. 5 Diversity indexes of soil microbal PLFA under

different levels of AgNPs stress

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-6.tif>[-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5

PC1（76.9%）][2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

-0.5

-1.0

-1.5

][PC2（10.8%）][CK

Ag10

Ag100

Ag1000]

图6 土壤微生物PLFA的主成分分析

Fig.6 Principal component analysis of soil microbial PLFA

2.5 不同处理组间微生物PLFA的差异

对土壤微生物PLFA丰度进行LEfSe分析。如图7所示，设定线性判别分析值 > 3.8，p < 0.050，共发现8种具有显著差异的特征PLFA。在对照组中，放线菌标志脂肪酸16：0 10Me被显著富集；在Ag10组中，G+标志脂肪酸a15：0和i16：0及放线菌标志脂肪酸18：0 10Me被显著富集；在Ag100组中，真菌标志脂肪酸18：2 ω6c及放线菌标志脂肪酸18：1 ω7c 10Me被显著富集；在Ag1 000组中，G-标志脂肪酸16：1 ω7c和18：1 ω7c被显著富集。结果表明，不同质量分数AgNPs能够显著改变土壤微生物群落结构。

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-7-1.tif>[CK

Ag10

][a][a: 5_16_010_methy1

b: S_18_010_methy1

C: S_18_lw7c10_methyl

d: p_Actinomycetes

e: S_16_00

f: S_18_1w9C

g: S_16_1w7c

h:S_18_1w7c

i: p_GramNegative

j: S_15_0anteiso

k: 5_16_Oiso

l: p _GramPositive

m: S_18_2w6c

][e][c][b][d][f][g][i][h][k][l][m][a][j][Ag100

Ag1 000]

<G:\武汉工程大学\2023\第6期\宋宇迪-7-2.tif>[b][p_ GramNegative

k _ Bacteria

s_18_1W7c

s_16 _lw7c

s_16_00

s_18_1w7c10_methyl

s_18_2w6c

p_ GramPositive

p_Actinomycetes

s_15_0anteiso

s_18_010_methyl

s_16_0iso

s_16_010_methyl

s_18_1w9c

][Ag1 000][CK][Ag10][Ag100][0 1 2 3 4

LDA SCORE（log 10）]

图7 微生物群落组间差异PLFA的 LEfSe 分析：

（a）进化分支图，（b）分布柱状图

Fig.7 LEfSe analysis of PLFA for differences in microbial communities： （a） cladogram， （b） distribution bar chart

Zhang等［38］发现，在未种植和种植黄瓜的土壤中，一些脂肪酸及其前体在AgNPs暴露下显著降低。PLFA的变化可能是由于AgNPs诱导生成了大量活性氧。Gunawan等［39］发现AgNPs破坏了磷脂酰乙醇胺中的磷酸胺和脂肪酸基团，并认为观察到的细胞膜损伤至少部分是由AgNPs在其浸出过程中产生的活性氧自由基所造成；细胞内膜磷脂上的包膜靶向可能会引起致死水平的细胞超氧化物和羟基自由基的快速生成。另外，微生物群落中的不同类群可能会对自身细胞膜上的PLFA作出调整，以应对AgNPs胁迫。

3 结 论

（1）不同水平AgNPs胁迫下，土壤微生物PLFA含量受到剂量依赖性的抑制作用；细菌和G-丰度受到一定的促进作用；G+/G-丰度比受到一定的抑制作用，真菌/细菌丰度比与AgNPs质量分数没有显著相关性（p > 0.050）。

（2）不同水平AgNPs胁迫下，土壤微生物PLFA多样性指数降低0.9%~3.2%（p < 0.050），微生物群落组间差异随AgNPs质量分数增加而增大。

（3）G+标志脂肪酸a15：0和i16：0、真菌标志脂肪酸18：2 ω6c，以及G-标志脂肪酸16：1 ω7c和18：1 ω7c的丰度在不同质量分数AgNPs处理组间具有显著差异（p < 0.050）。