《武汉工程大学学报》 2020年01期
60-65
出版日期：2021-01-25
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
含Glypican3单克隆抗体电子顺磁共振成像诊断剂的合成与性能
肝癌是全世界四大癌症致死疾病之一，其中90%的肝癌是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），且80%~90%的肝细胞癌都伴随有肝硬化（liver cirrhosis，LC），由于早期HCC临床症状与LC难以区分，患者往往在癌症晚期才会被确诊［1-3］。目前常用的肿瘤标记物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）存在假阳性和假阴性等缺点，降低了其对肿瘤检测的准确度。因此，对于肝癌细胞与肝良性病变鉴别的临床研究具有极其深远的意义［4-5］。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是一种位于细胞膜上的肿瘤胚胎期蛋白多糖，在肝癌细胞中特异性高度表达，而在正常细胞中不表达，因此GPC3被广泛用作为肝细胞癌的治疗靶点［6］。Glypican3单克隆抗体（glypican-3 monoclonal antibody，GPC3-mAb）可与GPC3特异性结合，被广泛用作肝癌识别基团［7］。
卟啉类衍生物是一类芳香类四吡咯化合物，存在于植物和动物体内，如叶绿素和血红素，能与癌细胞特异性结合并富集在肿瘤组织中［8］。卟啉可以通过插入到DNA的碱基中，导致其断裂而阻止肿瘤的形成。同时，卟啉类分子具有平面大环π-π共轭结构，易于被化学修饰，且能吸收可见光并发射荧光，具有较高的发光量子产率［9-11］。
电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）是由未配对电子的磁矩发展的一种磁共振技术，通过检测未成对电子探索其周围环境，具有灵敏度强、分辨率高的优点［12-18］。本文在催化剂的作用下，采用5-苯氧乙酸乙酯联吡咯甲烷为原料通过Lindsedy法成环法等一系列反应，将5-醛基异氮杂茚氮氧自由基（5-formyl-1，1，3，3-tetramethylisoindolin-2-yloxyl，FTMIO）和GPC3-mAb引入到卟啉环上，合成GPC3单克隆抗体电子顺磁共振成像诊断剂——5-（1’，1’，3’，3’-四甲基-异氮杂茚-2’-氧化氮自由基）-10，15，20-三（4"-氧乙酸基苯基）卟啉-GPC3抗体［5-（1’，1’，3’，3’-tetramethylisoindolin-2’-yloxyl-5’-yl）-10，15，20-tris（4"-carboethoxymethyleneoxyphenyl）-porph-yrin glypican-3 monoclonal antibody，TmioTCPP-GPC3-mAb］，并对其结构进行表征，进一步测试其荧光、电化学与EPR性能。
1 实验部分
1.1 化学试剂与材料
1.1.1 主要化学试剂 三氟化硼乙醚络合物、2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌、正己烷、三氟乙酸、无水硫酸钠、乙醇胺、N-（对-马来酰亚胺基苯基）异氰酸酯、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氢氧化钾、氢氧化钠、对羟基苯甲醛、乙酸乙酯、甲醇、四丁基氟化铵、溴乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。GPC3-mAb（分子量为66 kD，华中科技大学协和医院），-20 ℃下储存。吡咯用前重蒸，二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethyl-formamide，DMF）、乙醚、DMSO均除水重蒸后备用。FTMIO，实验室自制。
1.1.2 实验设备 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrum，FT-IR）用Thermo公司Nicolet Impact 420型傅里叶变换红外分析仪测定；质谱（mass spectrum，MS）用美国应用生物系统公司的Voyager-DE-STR激光时间质谱计测定；荧光激发光谱和荧光发射光谱用Varian Eclipse荧光分光光度计测定；EPR谱采用BRUKER A300电子顺磁共振波谱仪测定；电化学性能在CHI660D电化学工作站上测试。
1.2 实验方法
1.2.1 5-苯氧乙酸乙酯双吡咯的合成 称取6.5 g对羟基苯甲醛和9.78 g溴乙酸乙酯溶解于干燥丙酮（100 mL）中，并加入适量的K2CO3回流反应12 h，加水稀释到200 mL，用乙醚萃取3遍，取有机层用氢氧化钾洗涤3次，无水硫酸钠干燥过夜，真空干燥得对醛基苯氧乙酸乙酯（8.2 g，77.2%）。
避光氮气保护，将1.0 g对醛基苯氧乙酸乙酯和40 mL吡咯加入到三口瓶中，溶解完全后滴加0.05 mL三氟乙酸到反应液中，常温反应1.5 h，加入0.6 g 氢氧化钠终止反应，搅拌30 min后过滤，减压干燥，用硅胶层析柱分离提纯，真空干燥得到5-苯氧乙酸乙酯双吡咯（0.80 g，51%）。
1.2.2 5-（1’，1’，3’，3’-四甲基-异氮杂茚-2’-氧化氮自由基）-10，15，20-三（4"-氧乙酸基苯基）卟啉［5-（1’，1’，3’，3’-tetramethylisoindolin-2’-yloxyl-5’-yl）- 10，15，20-tris（4"- carboethoxymethyleneoxyphenyl）-porphyrin，TmioTCPP］的合成 在避光氮气保护下，将0.74 g 5-苯氧乙酸乙酯双吡咯和0.5 g FTMIO溶解在230 mL二氯甲烷中，在搅拌下将0.301 mL三氟化硼乙醚络合物加入到反应瓶中，反应1 h 。再加入0.401 g 2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌，搅拌反应12 h。减压干燥，柱层析分离提纯后真空干燥得到中间体5，10，15-三（4"-氧乙酸乙酯基苯基）-20-（1’，1’，3’，3’-四甲基-异氮杂茚-2’-氧化氮自由基）卟啉［5，10，15-tris（4"-aceticoxyphenyl）20-（1’，1’，3’，3’-tetramethylisoindolin-2’-yloxyl- 5’-yl）-porphyrin，TmioTECPP］（0.11 g，4.7%）。
在氮气保护下，将0.3 g TmioTECPP加到甲醇/ 氢氧化钠水溶液（体积比为1∶1）混合液中，在50 ℃下反应5 h，用甲醇萃取3遍，减压干燥得到产品TmioTCPP（0.2 g，72.7%）。
1.2.3 TmioTCPP-GPC3-mAb的合成 精确称量10 mg TmioTCPP 和0.6 μL乙醇胺溶于2 mL DMF中，再加入2.17 mg 二环己基碳二亚胺（dicyclohexyl- carbodiimide，DCC），常温下持续反应2 d，反应液真空旋干，用硅胶层析柱分离提纯，真空干燥得到中间体（5.2 mg，48.2%）。在避光氮气保护下再将其和1.3 mg N-（对-马来酰亚胺基苯基）异氰酸酯溶于DMSO中，常温反应2 h，真空除去溶剂，用硅胶层析柱分离提纯得到活化的TmioTCPP（紫红色，1.4 mg，56.4%），备用。
量取10 μL磷酸三（2-氯乙基）酯加入到GPC3-mAb 的磷酸盐缓冲液（1.515×10-5 mmol/mL，10 μL）中，室温搅拌30 min，将活化的TmioTCPP 的磷酸盐缓冲液（15.15 μL，1×10-4 mmol/mL）滴加至反应液中，室温反应2 h，透析12 h，冷冻干燥得到产品TmioTCPP-GPC3-mAb。合成线路如图1所示。
1.2.4 结构表征与性能测试 配制TmioTCPP- GPC3-mAb、TmioTCPP和FTMIO二氯甲烷溶液，以四丁基氟化铵（0.1 mol/L）为电解质，扫描速率为0.1 V/s，参比电极为Ag/AgCl，在CHI660D电化学工作站上三电极系统上测定其循环伏安性能。
配制TmioTCPP-GPC3-mAb和TmioTCPP的磷酸盐缓冲液，在荧光分光光度计上测定其激发波长与发射波长。
在氮气保护下，配制TmioTCPP-GPC3-mAb（1.5×10-10 mol/L）水溶液，在室温下用电子顺磁共振波谱仪测试EPR性能。
2 结果与讨论
2.1 TmioTCPP及其中间产物的表征
TmioTECPP按照文献［19］报道的方法合成，对应质谱图谱中的分子离子峰1 034.48（M+）［图2（a）］，与目标产物（C62H58N5H10，Mr=1 034）结果一致。
对TmioTECPP进行脱酯基处理，得到中间体TmioTCPP，对应质谱图的分子离子峰（M+H+）为949［图2（b）］，与目标产物（C55H46N5O10，Mr=948）结果一致。
2.2 TmioTCPP-GPC3-mAb的FT-IR表征
对TmioTCPP-GPC3-mAb进行FT-IR表征以确定产物结构，如图3所示，3 115 cm-1为卟啉环上N－H的伸缩振动吸收峰，在与GPC3-mAb偶联之后，被抗体的3 444 cm-1左右O－H吸收峰所覆盖，同时，2 900 cm-1左右出现明显的直链饱和烷烃（－CH2－，－CH3）的吸收峰，1 635 cm-1为酰胺（－CO－NH－）的吸收峰，1 384 cm-1为C－N面内弯曲振动吸收峰，1 200~900 cm-1出现明显的C－O的伸缩振动吸收峰，750~600 cm-1为酰胺（－NH2）的吸收峰。
2.3 TmioTCPP-GPC3-mAb的电化学性能
通过循环伏安法测定了TmioTCPP-GPC3-mAb的氧化还原性能，如图4所示。由图4中可以看出，TmioTCPP-GPC3-mAb的阳极电势在1.1 V附近出现，根据文献［20］计算，最高占有分子轨道能量EHOMO、最低占有分子轨道能量ELUMO、能隙Eg分别为-4.5 eV、-5.5 eV和1.1 eV。TmioTCPP-GPC3-mAb与TmioTCPP、FTMIO的相似的可逆氧化还原峰，其阳极电势稍有下降，可能是由于接上GPC3-mAb后，其位阻效应比较大，这进一步证明TmioTCPP成功与抗体GPC3-mAb偶联，结构稳定，并保持了良好的氧化还原性能。
2.4 TmioTCPP-GPC3-mAb的荧光性能
图5为TmioTCPP-GPC3-mAb的荧光激发光谱和荧光发射光谱。由图5可知，TmioTCPP-GPC3-mAb的最大激发波长和最大发射波长分别在416 nm和651 nm处，与TmioTCPP相比，GPC3-mAb的加入并未改变其激发强度，且具有相似的荧光性能，表明TmioTCPP成功与抗体偶联。
2.5 TmioTCPP-GPC3-mAb的EPR测试
图6为水溶性TmioTCPP-GPC3-mAb的EPR测试图谱，产物浓度约为1.5×10-10 mol/L，EPR信号较弱，这可能是由于产品的浓度过低。
3 结 论
本文采用Lindsedy法成环法等一系列反应直接将FTMIO引入卟啉环中，合成具有电子顺磁性能的水溶性TmioTCPP，再将肝癌靶向基团GPC3-mAb与TmioTCPP进行偶联，制备含GPC3单克隆抗体电子顺磁共振成像诊断剂。实验结果表明，水溶性TmioTCPP-GPC3-mAb具有与卟啉相似的荧光性能，并保持了FTMIO的氧化还原性能。GPC3-mAb是肝癌特征识别基团，且卟啉化合物能较好的富集在肿瘤组织部位，因此有望提高EPR诊断剂对肝癌的检测灵敏度。