《武汉工程大学学报》  2013年02期 1-5,10   出版日期：2013-02-28   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ
含卟啉基团小分子钆配合物的合成与表征


0引言在临床医学诊断中，肿瘤的及时、准确的发现对治疗起着至关重要的作用\[12\].磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技术是当前用于肿瘤检测与诊断的先进影像技术之一.磁共振成像造影剂（MRI contrast agent）能缩短体内局部组织中水质子的弛豫时间，提高成像对比度和清晰度\[3\]，可有效地区分病变组织与正常组织的差异，有利于进行疾病的早期诊断，这样不仅能够及时准确的对症下药，进行早期治疗，而且还能在很大程度上提高治疗效果，提高患者的治愈率和存活率.二乙三胺五乙酸钆（GdDTPA）是目前临床上应用最广泛的MRI造影剂，在体内主要循环于组织细胞外液间，没有特定的生理分布，因此GdDTPA在体内分布没有生物学专一性（靶向性）.另外，由于GdDTPA是以钠盐或葡甲胺盐的形式应用于临床，为离子型造影剂，故有渗透压偏高的问题，这些高浓度的钆类对比剂还不可避免地产生诸如肾系统纤维化（NSF）等毒性反应\[45\].因此，在造影剂的基本骨架上引入各种靶向基团进行化学修饰，制备得到非离子型配合物，不仅可赋予造影剂组织或器官的靶向性，而且可降低造影剂的渗透压、毒副作用\[68\].卟啉及其金属配合物对肿瘤具有特异的亲和性，注射入人体后会在肿瘤组织富集，因此卟啉化合物可用作为造影剂的肿瘤靶向基团\[914\].本研究用5（4氨基苯基）10，15，20三吡啶基卟啉对DTPA基本骨架进行化学修饰，合成一种小分子配体二乙三胺三乙酸二酰（5（4氨基苯基）10，15，20三吡啶基卟啉）（DTPA2APTMPyP），再与金属钆离子Gd（Ⅲ）配合，从而制备小分子造影剂二乙三胺三乙酸二酰（5（4氨基苯基）10，15，20三吡啶基卟啉）钆配合物（GdDTPA2APTMPyP），其具体合成路线如图1.并对所合成的配体及其配合物进行了FTIR、UV、1H NMR等结构表征，进一步研究了造影剂的体外弛豫性能与细胞毒性实验.图1肿瘤靶向造影剂（GdDTPA2APTMPyP）的合成路线Fig.1Synthetic route of tumortargeting MRI contrast agent (GdDTPA2APTMPyP)1实验部分1.1试剂及仪器二乙三胺五乙酸（DTPA）、4硝基苯甲醛、4吡啶甲醛、乙酸酐、氧化钆、浓盐酸、碘甲烷、无水乙醇、无水甲醇、无水乙醚、丙酸、三氯甲烷、二氯甲烷均为分析纯试剂；N，N二甲基甲酰胺（DMF）用CaH2干燥48 h后蒸馏备用.吡咯、吡啶用前蒸馏.1H NMR用Varian Mercury VX300 型核磁共振波谱仪于300 MHz下测定；FTIR用Nicolet Imapct 420 型傅里叶红外分析仪测定，KBr压片；UV用UNIC2802H UV/Vis Spectrophotometer紫外光谱测定；熔点用北京光电科学仪器厂XT4100x显微熔点仪（数字显示，温度校正）测定；自旋晶格弛豫时间（T1）用Varian MercuryVx300 NMR（300 MHz）核磁共振测定.第2期鄢国平，等：含卟啉基团小分子钆配合物的合成与表征武汉工程大学学报第35卷1.2配体及配合物的合成1.2.1配体DTPA2APTPyP二乙三胺五乙酸双酸酐（DTPAA）参照文献\[1516\]方法制备，5（4氨基苯基）10，15，20三吡啶基卟啉参照文献\[17\]方法制备.将0.8 g 5（4氨基苯基）10，15，20三吡啶基卟啉（1.28 mmol）加入到盛有20 mL DMF的烧瓶中，在冰浴磁力搅拌的条件下，缓慢加入0.20 g DTPA双酸酐（0.64 mmol），低温反应8 h后，室温下继续反应24 h.用无水乙醚沉淀，过滤干燥，收集固体.再用DMF无水乙醚重沉淀，真空干燥，即得配体DTPA2APTPyP 0.64 g，产率：81%.1.2.2钆配合物GdDTPA2APTMPyP的制备将0.6 g DTPA2APTPyP（0.36 mmol）溶于20 mL DMF中，搅拌缓慢加入0.16 g CH3I（1.08 mL），40 ℃下反应4 h.加入200 mL无水乙醚，产生红褐色沉淀.过滤，再用DMF无水乙醚进行重沉淀，真空干燥，即得配体DTPA2APTMPyP 0.44g，产率74%.将0.3 g配体DTPA2APTMPyP（0.14 mmol）溶于8 mL甲醇中，搅拌缓慢加入0.045 g GdCl3·6H2O（0.14 mmol），室温下反应2 h.用甲醇无水乙醚重沉淀，过滤，乙醚洗涤，干燥，得到深褐色固体，即金属配合物GdDTPA2APTMPyP 0.255 g，产率85%.1.3钆配合物弛豫时间的测定将钆配合物GdDTPA2APTMPyP溶于二次蒸馏水中，配成浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mmol/L的溶液；同样上述方法，配制浓度为0.15 mmol/L的GdDTPA溶液.调节至pH 7~8，以返转回复法在Varian MercuryVX300 NMR（300 MHz）核磁共振仪上测定溶液中质子的自旋晶格弛豫时间T1，并计算弛豫率.1.4钆配合物体外细胞毒性实验用培养液调节HeLa细胞浓度为60 000~80 000 个/毫升，取96孔培养板加样，每孔100 μL（6 000~8 000个/孔），在37 ℃，体积分数5％的CO2培养箱中培养24 h.待HeLa细胞长满孔底之后去掉培养液，加入含不同浓度的小分子钆配合物（GdDTPA2APTMPyP 或者GdDTPA）的新鲜培养液，对照组则加入不含钆配合物的新鲜培养液.继续培养48 h.用培养液洗涤一次，加入100 μL的培养液、四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液（5.0 mg/mL，20 μL/孔），继续培养4 h.弃去上清液，以3%小牛血清磷酸缓冲盐水洗二次，倾干液体，加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），摇匀，室温放置30min.以无细胞空白孔为零点，选取5个平行样，测量OD570值，计算细胞相对存活率.2结果与讨论2.1红外表征配体和配合物的红外光谱图如Fig.1，配体DTPA2APTMPyP在3 436 cm-1为υN-H和υOH的叠加，1 653 cm-1和1 624 cm-1为酰胺键和羧酸根中的υC=O；配合物GdDTPA2APTMPyP在1 653 cm-1和1 624 cm-1消失，蓝移至1 593 cm-1，说明配体在形成配合物后羧酸根和酰胺键中的羰基与金属离子发生了配位作用. 图2DTPA2APTMPyP和GdDTPA2APTMPyP的红外光谱图Fig.2FTIR spectra of DTPA2APTMPyP andGdDTPA2APTMPyP2.2紫外表征配体和配合物的紫外光谱图如图3、4.在紫外可见光谱中，卟啉化合物特殊的化学结构，表现在Soret带有一个很强的吸收峰；在可见光区存在4个较弱的Q吸收带.图3DTPA2APTMPyP的紫外图谱Fig.3UVVis spectrum of DTPA2APTMPyP图4GdDTPA2APTMPyP的紫外图谱Fig.4UVVis spectrum of GdDTPA2APTMPyP由图3可知配体 DTPA2APTMPyP的紫外吸收峰为λmax：427，515，558，590，654 nm；由Fig. 4可知配合物GdDTPA2APTMPyP的紫外吸收峰为λmax：419，510，549，587，644 nm.对比可得：配合物的Q带吸收峰存在一定程度的蓝移，这是由于配体与Gd配合，溶液的极性增强造成的.2.3核磁共振表征配体DTPA2APTPyP的核磁图谱（图5）的吸收峰（化学位移）和各自归属为：1H NMR（d6DMSO，δ，ppm）：9.49（d，6H，metapyridine），9.21（d，2H，βpyrrole），9.13（d，4H，βpyrrole），9.00（d，2H，βpyrrole），8.48（s，1H，amino），8.43（m，2H，aminophenyl），8.15（m，6H，orthophenyl），4.71（m，6H，NCH3），3.10（s，4H，2×CH2—COOH），2.97（m，4H，2×CH2—CO—NH），2.90（t，4H，2×N—CH2），2.73（s，2H，CH2COOH），2.67（t，4H，2×N—CH2）.图5DTPA2APTPyP的核磁图谱Fig.51H NMR spectrum of DTPA2APTPyP2.4钆配合物对水质子弛豫性能的影响顺磁性MRI造影剂通过增强水质子的弛豫效率从而提高磁共振成像的效果，本实验表现为增强其对溶剂中水质子的弛豫速率，用自旋-晶格弛豫率R1表示提高磁共振成像的效果，由下式表示：（1/T1）obsd=（1/T1）d+R1\[M\]（1）上式中（1/T1）obsd和（1/T1）d分别为有顺磁性物质存在时观察到水质子的纵向弛豫速率及作为空白样的纯水中质子的弛豫速率.R1溶液中顺磁性物质的弛豫率、\[M\]为溶液中顺磁性物质的摩尔浓度.当R1值越大时表明其弛豫能力越强，即对水质子的弛豫影响更大，活体的成像效果更好.表1为钆配合物GdDTPA2APTMPyP在不同浓度（0.1~1.1 mmol/L）的水溶液中所测得的溶剂水分子氢核纵向弛豫时间T1，以及所计算出的相对应的弛豫速率A，即1/T1. 图6GdDTPA2APTMPyP在水溶液中的弛豫性能Fig.6Relaxivity of GdDTPA2APTMPyP in water solution由Table 1的数据作图（图 6），从图中可知随着配合物浓度的变化，溶剂中水分子中质子的弛豫速率A呈线性变化.其中横坐标X为水溶液中配合物GdDTPA2APTMPyP的摩尔浓度，纵坐标Y为纵向弛豫时间T1的倒数，即弛豫速率.表1弛豫率数据Table 1Experimental data of relaxivityGdDTPA2APTMPyP\[M\]/(mmol/L)(T1)/(obsd/s)(1/T1)/(obsd/s-1)R1/(mmol-1·L·s-1)11.10.178±0.0125.636±0.3894.809±0.36920.90.222±0.0074.509±0.1894.626±0.21530.70.269±0.0223.734±0.3064.839±0.46140.50.383±0.0242.623±0.2114.552±0.44350.30.571±0.0291.753±0.0914.689±0.33260.11.261±0.0810.794±0.0514.476±0.585GdDTPA0.20.924±0.0451.084±0.0543.687±0.281注： T1在19 ℃，300 MHz下测得；相同条件下纯水的T1d=（2.89±0.017） s，1/T1d=（0.346±0.021） s-1.根据图6的趋势线做线性拟合，相关系数为0.999，得下式（1/T1）obsd=0.296+ 4.798\[GdDTPA2APTMPyP\]（2）对照上式，可见GdDTPA2APTMPyP的弛豫率为4.798 mmol-1·L·s-1,该值高于GdDTPA的弛豫率（3.687 mmol-1·L·s-1）.实验结果表明，GdDTPA2APTMPyP对水质子的弛豫速率有较好的加速作用，弛豫率较高，有利于获得良好的成像效果.图7钆配合物对HeLa细胞的体外毒性Fig.7In vitro cytotoxicity assay of the gadoliniumcomplex to HeLa cells2.4钆配合物的细胞毒性实验从图 7可知，当培养液中钆配合物质量浓度为5 μg/mL时，用含GdDTPA培养液培养的HeLa细胞的相对存活率为89%，而用含GdDTPA2APTMPyP培养液培养的HeLa细胞的相对存活率为89.8%；当培养液中钆配合物质量浓度为100 μg/mL时，用含GdDTPA培养液培养的HeLa细胞的相对存活率为73%，而用含GdDTPA2APTMPyP培养液培养的HeLa细胞的相对存活率为60.0%.3结语用二乙酸酐五乙酸（DTPA）脱水制得二乙酸酐五乙酸双酸酐（DTPAA），再与卟啉化合物进行反应，合成小分子配体，然后与金属钆离子进行配合制得水溶性小分子造影剂.对所得的配体和配合物进行结构表征与体外性能研究.实验结果表明，与GdDTPA相比，这类小分子磁共振成像造影剂具有较高的弛豫率，对HeLa细胞具有相似的体外细胞毒性.将进一步研究小分子造影剂的肿瘤靶向性能与体内外磁共振成像性能.致谢感谢国家自然科学基金委、武汉市科技攻关计划项目组、武汉工程大学第三届研究生创新基金组的资助.