《武汉工程大学学报》 2010年03期
44-46
出版日期：2010-03-31
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选
0引言黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD)是体内核酸代谢中重要的酶, 能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸, 同时产生过氧化物自由基［1］．尿酸浓度过高将导致高尿酸血症, 可引起痛风发作．自由基涉及到炎症等一系列病理过程［2］．因此, 抑制XOD的活性, 既可以减少体内尿酸的形成, 有效地阻止或延缓痛风及其并发症, 又可以减少自由基造成的组织伤害［3］．目前黄嘌呤氧化酶抑制剂(XOI)别嘌呤醇自上市后沿用至今, 是治疗痛风的主要药物．但常伴有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少, 肝功能损害等严重副反应［4］．因此, 研制开发新的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有实际意义． 黄酮类化合物广泛存在于中草药中, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、抗心脑血管疾病等多种药理作用．根据有关文献［5］中黄嘌呤氧化酶抑制剂的构效关系及应用前景, 笔者从多种中草药制备提取物, 这些提取物主要含有黄酮类化合物［67］, 并进行了体外黄嘌呤氧化酶抑制实验．1实验部分1.1实验材料与仪器枳椇子和高良姜购于武汉市雄楚大街三九药店, 葛花购于湖北省中医院, 这3种药材均经中南民族大学万定荣教授鉴定．枳椇子为鼠李科植物枳椇（Hovenia dulcis Thunb）的干燥成熟种子．高良姜为姜科植物高良姜 （Alpinia officinarum Hance）的干燥根茎．葛花为豆科植物野葛［Pueraria lobata（Will.）Ohwi］的干燥花．T6新世纪紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器公司), 带有动力学／时间软件． 黄嘌呤氧化酶(北京世纪山水科技公司), 黄嘌呤(Sigma公司), 槲皮素(中国药品生物制品检定所), 二甲基亚砜(Amresco公司), 其余试剂均为分析纯．1.2植物提取物的制备 分别将各种植物材料粉碎成粗粉, 称取材料10.0 g用索氏提取器进行提取, 溶剂为不同浓度的乙醇和乙酸乙酯．提取液用旋转蒸发器回收溶剂, 干燥剩余物, 分别得到各种提取物．1.3研究方法
1.3.1溶液配制缓冲液：取K2HPO4、KH2PO4 、EDTA2Na溶于500 mL水, 配成 0.2 mol/L 缓冲溶液 (pH7.5)．酶溶液：取黄嘌呤氧化酶, 用缓冲液配成浓度为1.144 units/mL的溶液．测试过程中利用冰袋保持低温, 需每天配制．底物溶液：精密称取黄嘌呤溶于水, 制得0.10 mmol/L和0.05 mmol/L底物溶液, 室温保存．样品和对照品溶液：精密称取各样品及阳性对照品槲皮素, 分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解, 得到不同浓度的溶液．
1.3.2酶活力测定在适宜条件下, 黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸, 产物尿酸290 nm处有特征吸收峰, 因此以每分钟290 nm处吸光度的增加来计算酶活力（dA/min）（dA为吸光度的增加值）．在任意一个适当长的时间段内, 吸光度随时间呈线性增加, 斜率为反应速率(dA/min), 斜率越大, 说明酶的活力越强, 具体操作参照文献［5］．在石英比色皿中, 加入缓冲溶液、底物溶液、酶溶液, 测定290 nm处吸光度增加值, 每隔0.5 s记录一次, 共测 1 min, 得到一条关于吸光度—时间的直线, 计算直线斜率Rate(dA/min)．
1.3.3样品测定按同样的方法, 在酶促反应体系中加入适量样品溶液, 每隔0.5 s记录290 nm处吸光度变化值, 共计1 min．每个样品平行操作3次, 取其平均值计算该样品的抑制率．
1.3.4空白对照同上述操作, 加与样品同样体积的DMSO, 不加样品和XOD．
1.3.5XOD对照品测定方法与样品测定相同, 不加样品．
1.3.6阳性对照品为核对实验方法与结果的可信性, 取已配制好的不同浓度的槲皮素溶液, 重复上述实验, 计算IC50值．
1.3.7抑制动力学常数Ki值的测定及计算使用2个不同浓度的黄嘌呤溶液, 获得不同浓度样品溶液对XOD的反应速率, 用Dixon绘图法计算Ki值［8］．2结果与讨论 2.1样品对XOD的抑制率 计算公式为［（Rp Rs）/Rp ］ ×100％．式中 Rs、Rp分别表示样品、XOD对照品(已减去空白对照)的反应速率．按照上述方法进行分析, 底物浓度为0.10 mmol/L, 样品浓度均为100 μg/mL, 槲皮素为10 μg/mL, 得到对黄嘌呤氧化酶抑制作用较强的植物提取物, 分别为枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物．其抑制率如表1所示．表1各提取物对XOD的抑制效果
Table 1Inhibitory activity of extracts on XOD
样品来源抑制率/%IC50/（μg/mL）Ki/（μg/mL）枳椇子88.426.496.166高良姜70.1147.6863.958葛花62.0764.7813.890槲皮素94.250.7180.133第3期黎莉，等：中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选
武汉工程大学学报第32卷
2.2半数抑制浓度IC50 以抑制率为因变量, 以样品浓度为自变量, 采用SPSS 15.0统计软件包计算回归方程．根据回归方程计算抑制率为50％的样品浓度IC50．实验结果如表1所示．2.3Ki值计算和抑制剂类型用Dixon绘图法计算Ki值, 判断抑制剂类型．在不同浓度的底物下, 以反应速率的倒数为因变量, 样品浓度为自变量, 得到一条直线．采用 SPSS 15.0统计软件包计算回归方程．求出两直线的交点, 可得到抑制动力学参数Ki［9］．再由直线的斜率对相应的底物浓度的倒数二次作图, 即可判断抑制剂类型［10］．本实验中的植物提取物均为竞争性抑制剂, 其动力学参数如表1和图1～4所示．图1黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系中枳椇子的Dixon图
Fig.1Dixon plots drawn by reciprocal of urate formation rate versus Semen Hoveniae concentration in xanthine／XOD system图2黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系中高良姜的Dixon图
Fig.2Dixon plots drawn by reciprocal of urate formation rate versus Rhizoma Alpiniae officinarum concentration in xanthine／XOD system图3黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系中葛花的Dixon 图
Fig.3Dixon plots drawn by reciprocal of urate formation rate versus Flos Pueraiae concentration in xanthine／XOD system图4黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系中槲皮素的Dixon图
Fig.4Dixon plots drawn by reciprocal of urate formation rate versus Quercetin concentration in xanthine／XOD system3讨论a．IC50值反映样品对黄嘌呤氧化酶活性抑制的强弱, 该数值低则抑制作用强．枳椇子乙醇提取物抑制作用最强．Ki值是表征抑制剂对酶促反应抑制效率的重要参数, 该值越小, 则表明抑制剂对该酶促反应抑制效果好．与化学单体槲皮素相比, 本实验筛选的3种提取物的IC50值和Ki值较大, 但由于提取物是混合物, 经济且制备容易, 还具有多重作用, 故仍然具有实际意义和应用价值．b．枳椇子、高良姜和葛花属常用中药, 长期用于治疗各种疾病, 毒性小．未见其抑制黄嘌呤氧化酶活性而治疗痛风的报导．本实验将对其做后续研究, 有可能发现其新用途, 为充分利用这些植物资源提供依据．